第一部分骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨及成软骨分化研究目的：建立并完善人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，探讨其体外成骨及成软骨分化能力。方法：1．骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养：自愿者知情同意，按标准骨髓穿刺程序，从髂后上棘处抽取骨髓5-10mL，肝素抗凝，加于Ficoll淋巴细胞分离液上,离心，以1×106个细胞接种于含基础培养基（10%FBS低糖DMEM，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）的培养皿中培养。培养72h后首次换液，以后每隔3d换液。2．骨髓间充质干细胞（BMSCs）的鉴定：取培养至3代（P3）的细胞，抗体标记后，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表型（CD44、CD73、CD90）；3．BMSCs的成骨分化诱导及鉴定：取培养至第3代细胞，以3×105/孔接种于6孔板中。实验分为4组：对照组、成骨诱导1，2，3周组。对照组用基础培养基培养，成骨诱导组用成骨诱导培养基（含体积分数10%FBS低糖DMEM培养基，0.1μmol/L地塞米松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/L β-磷酸甘油钠，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）分别培养1，2，3周。进行碱性磷酸酶活性测定、Gorimo、茜素红、Von kossa染色鉴定，并RT-PCR检测成骨细胞特异基因Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、骨唾液酸蛋白（BSA）、骨桥蛋白（OPN）及骨连接蛋白（ONN）基因的表达。4．BMSCs的成软骨分化诱导与鉴定：取培养至第3代细胞，以3×105/孔接种于6孔板中。实验分为4组：对照组、成软骨诱导1，2，3周组。对照组用基础培养基培养，成软骨诱导组用成软骨诱导培养基（1mmol/L丙酮酸钠0.1mmol/L抗坏血酸，0.1umol/L地塞米松，1%ITS，10ng/L TGF-β1）分别培养1，2，3周。进行阿尔新蓝染色及II型胶原免疫组化鉴定，并RT-PCR检测成软骨细胞特异性基因CollageⅡ、CollageX、COMP及aggrecan的表达。结果：1．相差显微镜观察：原代BMSCs培养72h后换液，即可观察到贴壁细胞，细胞形态短小，呈长梭形、纺锤形。培养至7d，细胞明显增多、变长、变大，长梭形、纺锤形形态更加明显。14d时，细胞基本铺满皿底，细胞排列呈螺旋状或漩涡状。传代培养中，细胞基本保持长梭形的形态。2．流式细胞仪(FCM)检测发现BMSCs阳性表达间充质细胞表面标志CD44、CD73、CD90，阳性率均90%以上。造血干细胞表面标志CD34、CD45表达阴性。3．BMSCs成骨诱导鉴定：成骨诱导后，Gomori、茜素红、Von Kossa染色均为阳性，BMSCs中ALP少量表达，成骨诱导3d、6d、2w、3w、4w时ALP活性显著增强，并随着诱导时间的增长，ALP活性亦随之增加。RT-PCR显示诱导的BMSCs有CollagenⅠ、ALP、OCN、BSP、OPN、ONN基因的表达。4．BMSCs成软骨诱导鉴定：成软骨诱导后，阿尔新蓝染色阳性，BMSCs诱导四周后的微球免疫组化显示有II型胶原的表达。RT-PCR显示诱导的BMSCs有成软骨细胞特异性基因CollageⅡ、CollageX、COMP及aggrecan的表达。结论：1.建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案，骨髓间充质干细胞阳性率高，传代不丧失遗传稳定性，为以后的BMSCs临床应用提供了可靠的参考依据。2. BMSCs具有很好的成骨及成软骨分化特性，可用于自体移植，无免疫排斥反应，可成为组织工程较为理想的种子细胞。第二部分Corin在骨代谢过程中的表达及其生物学机制研究Corin是心脏中发现的一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，可将心钠素前体（pro-atrialnatriuretic peptide, pro-ANP）转化成有活性的ANP，从而调节血压和心脏功能。最近有研究报道，corin在发育着的骨组织中也有表达，骨代谢是骨形成（成骨细胞）和骨吸收（破骨细胞）不断重复进行的过程，骨质疏松症是骨代谢疾病中最常见的形式，骨质疏松症的形成主要是因为骨吸收超过了骨形成，进而引起骨量的减少。那么研究骨质疏松症患者血清中可溶性corin及骨代谢过程中corin的表达，有助于进一步了解corin的结构和功能以及参与骨代谢过程的生理病理意义。目的：体外模拟体内骨形成的过程，探讨corin在骨形成过程中的表达情况，检测骨质疏松病人血清中可溶性corin水平，探讨corin的表达与骨质疏松的关系及其临床意义,进而探讨corin在骨代谢过程(成骨发生及破骨吸收)中的表达及其生物学作用。方法：1．骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养及成骨及成软骨分化，及分化过程中mRNA的提取。2．利用反转录PCR（RT-PCR）技术对BMSCs、成骨细胞、成软骨细胞corin mRNA的表达进行分析；3．实时定量PCR（qRT-PCR）检测BMSCs、成骨诱导（1，2，3周）、成软骨诱导（1，2，3周）corin mRNA的表达；4．采集正常人、单纯骨折病人、骨量减少及骨质疏松症病人的外周血于2小时内3,000g离心10min，取上层血清，分装保存。5．应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测125例正常人、102例单纯骨折病人、53例骨量减少病人、101例骨质疏松症病人血清标本的可溶性corin。结果：1． Corin mRNA在BMSCs、成骨细胞及成软骨细胞中均有表达。2．随着BMSCs成骨及成软骨诱导时间的逐渐增加，corin mRNA的表达量也呈逐渐增加的趋势。3．骨量减少与骨质疏松症病人血清中的corin水平明显低于正常对照组与单纯骨折组（510±228and478±183pg/mL vs.695±248pg/mL and706±345pg/mL,P<0.001），而骨量减少与骨质疏松症病人组相比、正常对照组与单纯骨折组相比均无统计学意义（P>0.05）；4．在骨质疏松症病人组，无论男性与女性患者血清corin水平均显著低于正常男性与女性(男性组894±257vs.643±198pg/mL, P<0.05;女性组595±172vs.438±155pg/mL,P<0.001)；5．在骨量减少与骨质疏松症组，我们发现血清corin值与病人骨密度值存在线性相关关系（P=0.03）。6．多元线性回归分析结果提示病人病史（高血压病，P <0.05）是一个相关因素。另外，性别也是血清corin水平的独立相关因素（P <0.001）。结论：1．Corin在BMSCs、成骨细胞及成软骨细胞中均有表达，且在骨及软骨形成的过程中corin的表达是上调的。2．与正常人比较，骨质疏松症病人血清中的可溶性corin蛋白表达水平显著降低。3．在骨量减少与骨质疏松症病人中，血清中的corin水平与骨密度呈线性相关。且血清中corin水平随疾病严重程度而进行性下降趋势。提示，血清中可溶性corin水平可能为骨质疏松症的诊断及评估病情提供新的依据。