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本实验选取莱航鸡、长白猪、荷斯坦奶牛三种动物为研究对象,运用分子克隆技术,分别对这三种动物杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的N端活性部位基因进行克隆和序列分析。为进一步了解鸡、猪、牛BPI基因的生物学功能、研制开发防治GNB感染性疫病的重组BPI生物制剂提供科学的理论基础。实验结果如下:1 PMNs及其RNA的提取采用密度梯度离心法,分离出猪、牛嗜中性粒细胞(PMNs ),并将此法加以改进,成功地分离鸡PMNs。实验表明,三种动物鸡、猪、牛的PMNs浮力密度分别为1.085～1.090 g.mL-1、1.080～1.085 g.mL-1、1.080～1.086 g.mL-1。应用Trizol Reagent试剂盒抽提RNA法,对三种动物的PMNs进行RNA抽提,经2.0%琼脂糖凝胶电泳后出现28S和18S RNA两条清晰的条带,说明所提RNA的完整性可用于RT-PCR扩增;分光光度计检测其RNA在260nm和280nm时的OD值,计算鸡、猪、牛RNA OD260/OD280值分别为1.8、1.7、1.9。实验所得RNA纯度很高,满足实验要求。2引物设计与RT-PCR扩增根据Genbank中登录的鸡、猪、牛BPI N端基因序列,自行设计了三对引物(鸡:P1 5’ CGGAATTCATGCTGGCAAGGTCTGGAGG 3’ ,P2 5’ ATAAGAATGCGGCCGCCCGGGACCACGGAT 3’;猪:P3 5′GCGTCGACATGACTTTGACCTGAGTGTGGAGG 3′,P4 5′CGAAGCTTCAGGCTGCTGCCGGACGT 3′;牛:P5 5′ACCAACCCTGGCATTGTC 3′P6 5′AGACTCGATTCGTTTGCG 3′)。在引物P1、P2的5′端设计了EcoR I、Not I酶切位点和相应的保护碱基,以便于对鸡BPI基因进行定向克隆和鉴定。运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,首先反转录合成鸡、猪、牛BPI基因的cDNA第一链,然后PCR扩增cDNA。电泳结果显示三种动物的BPI基因RT-PCR产物分别约在280bp、140bp、500bp处出现特异性条带。3鸡BPI基因的克隆及鉴定将鸡BPI基因的RT-PCR产物纯化,插入到克隆载体pMD-18的多克隆位点中,构建重组质粒pMD-18-BPI,转化大肠杆菌DH5α,Amp抗性筛选,得到阳性克隆质粒。并将该阳性克隆质粒进行PCR鉴定,电泳得到约280bp大小的特异性条带;为进一步确定外源基因的存在,将初步怀疑为的阳性克隆质粒用EcoR I、Not I进行双酶切鉴定,电泳结果显示,获得了预期大小(284bp)的基因片段;说明BPI基因已插入pMD-18,重组质粒构建成功。4 BPI基因的序列测定与分析将鉴定后的鸡阳性克隆质粒pMD-18-BPI和猪、牛BPI基因的RT-PCR产物测序。测序结果显示:从鸡PMNs的RNA中扩增获得了大小约为284bp的BPI N基因片段;从猪PMNs的RNA中扩增获得了大小约为144bp的BPI N基因片段;从牛PMNs的RNA中扩增获得了大小约为500bp的BPI N端基因片段。将测定的序列结果进行BLAST,比对结果显示:鸡BPI基因序列与报道序列基本一致,有三个碱基发生突变;猪BPI基因序列与报道序列一致;牛BPI基因序列与报道的有两个发生突变;而三种动物BPI的氨基酸序列都分别同报道的氨基酸序列完全一致。运用DNAstar分析软件对实验所得目的基因片段序列进行分析,结果表明猪、牛BPI N端基因序列同源性达到了86%,氨基酸列同源性达到了75%;而鸡BPIN端氨基酸序列与猪、牛BPI N端氨基酸序列同源性很低。以上结果表明:本实验依据哺乳动物PMNs密度梯度离心的提取方法,在提取猪、牛PMNs的基础上,将分离液的密度梯度加以改变,提取了鸡PMNs;本实验成功的克隆出鸡、猪、牛BPI N端部分基因序列。