目的：　　 一、尝试以双功能螯合剂cDTPA连接Gd和D-二聚体抗体制备血栓MR靶向对比剂。为了检测合成的血栓MR靶向对比剂的纯度、稳定性等性质及其在活体内的生物分布情况,我们首先采用传统的放射免疫技术,采用相似的方法以cDTPA连接99mTc和D-二聚体抗体,观察抗体在血栓模型体内的分布情况,并行ECT小动脉血栓靶向成像,比较两种靶向显像在小动脉血栓方面的成像效果；　　 二、尝试建立制作方法简单、成功率高、重复性好,形成体积较大并稳定的小动脉血栓模型；　　 三、将Gd标记抗D-二聚体单克隆抗体注入大鼠体内,于多个时间点行大鼠股动脉血栓MR显像,与注射Gd-DTPA的大鼠股动脉血栓MR显像效果比较,探讨前者在小动脉血栓定位诊断中的作用,并探讨其潜在应用价值。　　 材料和方法：　　 (一)99mTc-DTPA-鼠抗人D-二聚体抗体的制备及检测　　 1.1 抗体的制备及标记将纯化的鼠抗人D-二聚体抗体置于碳酸氢盐缓冲液中,4℃透析过夜,并用该缓冲液调节抗体浓度至1mg/ml。cDTPA溶于无水二甲亚砜(DMSO)中,密闭置于干燥剂中保存。按cDTPA与抗体的摩尔比为30:1在pH8.2缓冲液中进行反应,乙酸终止反应。按1μCi/μg抗体投入高锝酸盐,pH6.0醋酸盐缓冲液中作用30min,新华Ⅰ号滤纸层析展开,展开液为:丙酮与EDTA(6mmol/L),二者体积比为2:1,GC-911型NaI晶体γ计数仪测定cpm,计算标记率。　　 1.2 放化纯度、比活度、稳定性测定标记产物用GE Healthcare Sephadex G25层析柱纯化去除游离的DTPA和99mTc,纸层析法测定放化纯度,同时用Beckman334型(TSK3000)高效液相色谱仪验证。蛋白浓度用紫外分光光度计测定,并根据标记产物放射性计算比活度。取纯化产品500μl加入等体积的大鼠血清,分别在0、3、6、12、24h取样纸层析展开,分析解离率。　　 1.3 免疫活性测定首先用裂解液裂解大鼠全血,离心提取其中的蛋白,置于10％聚丙烯胺凝胶上电泳,(已知D-二聚体分子量为62 KDa),再将凝胶上的蛋白转移后NC膜上。将NC膜用TBS溶液浸润后,放于盛有封闭液的平皿中,于摇床上20℃,80r/min封闭2h。将一抗于不同通道上与膜蛋白孵育1～2h,用TBS封闭NC膜再用标记前标记后的抗体在不同通道上与抗原(D-二聚体)特异性结合形成抗原抗体复合物,将一抗孵育后的NC膜置于TBST缓冲液中,于摇床上20℃,80r/min清洗两次,每次10min。然后再用TBS缓冲液洗一次,10min。清洗除去未结合的抗体和蛋白,NC膜上就只有结合着抗体的D-二聚体。用HRP标记的羊抗大鼠二抗与抗体结合,再用底物酶催化显色产生可见的区带,比较标记前的抗体与标记后的抗体产生的区带,观察区带是否有差异。　　 (二)Gd—DTPA-鼠抗人D-二聚体抗体的制备及检测2.1抗体的制备将纯化的鼠抗人D-二聚体抗体置于碳酸氢盐缓冲液中,4℃透析过夜,并用该缓冲液调节抗体浓度至1mg/ml。cDTPA溶于无水二甲亚砜(DMSO)中,密闭置于干燥剂中保存。按cDTPA与抗体的摩尔比为30:1在pH8.2缓冲液中进行反应,乙酸终止反应。按方法1.1的摩尔数投入GdCl3,过层析柱去除游离的Gd3+和DTPA纯化。　　 (三)大鼠股动脉血栓模型成像研究　　 1.实验动物正常SPF级Wistar大鼠18只,由南方医院动物实验中心提供,雌雄不限,体重300—500g。　　 2.模型的建立　　 2.1 大鼠血栓模型的建立:实验Wistar大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉,在腹股沟区剪开皮肤,分离皮下组织,找到并游离股动脉,以血管夹夹闭股动脉近心段,在距离钳夹位置约1cm处用微量注射器抽出该段血液,再注入约20μl的凝血酶,这时再用一血管夹夹闭注射位置的远心端,两个血管夹维持70—163min,确保血栓稳定不易游走,脱落。实验终点点为3h,可观察都被钳夹的血管段颜色变暗,同侧肢体远端皮肤温度降低,皮肤由红润变为暗紫色,动脉搏动消失。提示血栓已形成,松开血管钳后,用肝素生理盐水冲洗术区残留的血液,并用纱布或棉球吸干,缝合切口。喂养4天后,随机处死3只大鼠,大体病理及镜下病理观察是否有血栓形成。　　 2.2 采用随机数字法将已建成股动脉模型的大鼠其分为三组:1、核素扫描组5只,抗体剂量0.01μmol/g2、MR扫描组10只:抗体剂量0.0lμmol/g,Gd—DTPA剂量0.17μmol/g。　　 3.核素扫描方法将99mTC-DTPA-鼠抗人D-二聚体抗体以单抗剂量为20μg/kg注射已建成股动脉血栓的大鼠模型,99mTC注射的比活性为14.8MBq/kg,分别于注射后5min、30min、1h、3h和6h用SPET显像,观察其现象。检测后处死动物,取股动脉血栓和心、肝、脾、肺、肾、膀胱分别测出放射性含量。计算各个组织器官单位重量组织器官的放射性计数占注入剂量的百分数。　　 4.MR扫描方法MRI扫描(GE Signa EXCITE HD)3.0TMR超导型磁共振扫描仪)采用软线圈,横断面扫描,扫描参数为FSE T1WI(TR/TE=400ms/7.5ms)。增强后加做压脂序列。10只形成股动脉血栓的大鼠分为2组,其中经尾静脉注射Gd-DTPA-鼠抗人D-二聚体抗体5只,Gd-DTPA对照组5只。对实验动物行MR扫描,测量SET1WI平扫及增强后5min、10min、30min、60min图像内血栓信号强度并计算信号强度比,绘制时间信号强度比曲线。　　 5.图像分析　　 5.1 观察血栓部位于ECT图像上显示的亮度,并进行计数,测出大小。　　 5.2 测量MR图像上2组实验动物各时间点T1WI像上血栓信号强度及对侧股动脉信号强度,在背景区域选取较大的ROI,测背景噪声的标准差。计算血栓及对侧股动脉各时间点的信号强度比。　　 6.统计学分析,使用SPSS16.0软件包　　 6.1 采用单个重复测量因素的方差分析,对血栓和心、肝、脾、肺、肾、血液的单位重量组织器官放射性计数占注入剂量百分数做多重比较进行分析(P<0.05)。　　 6.2 采用单个重复测量因素的方差分析,2组MR对比剂血栓部位和对侧股动脉于各个时间点的信号强度比(P<0.05)。　　 结果：　　 1.计算出99mTc标记抗体的标记率为82％,放射化学纯度92％,比活度为0.8mCi/mg,6h后测定的解离率为8％。　　 2.Gd和99mTc标记后的抗体均具有免疫活性。　　 3.肉眼大体病理实验段血管可以明显看到血管内红色的血栓,而正常的血管是透明的,光镜下的观察结果股动脉管腔内可见呈粉染半透明分枝状的血小板小梁和网状排列的纤维素,纤维网眼中可见大量红细胞等混合血栓成分。　　 4.注射99mTc-DTPA-D-二聚体抗体后,5只大鼠的股动脉血栓其单位重量组织器官的放射性计数占注入剂量的百分数(0.105)仅低于肾脏(0.797)而高于血液(0.015)；血栓部位聚集的99mTc-DTPA-D-二聚体抗体是特异性聚集,因其高于血液本底。　　 5.大鼠尾静脉注射Gd-DTPA后,其股动脉血栓信号强度比于各个时间点无明显差异(P=0.056),即无明显强化；且与对侧股动脉于5min,10min及60min时间点上有差异,在这几个时间点上均数均低于对侧股动脉。大鼠尾静脉注射Gd-DTPA-鼠抗人D-二聚体抗体后,其股动脉血栓信号强度比于各个时间点有明显差异(P=0.005),即有强化,且在10min点上血栓信号强度比的均数最高,这与MR图像在10min的点显像最佳相符。在10min与30min这2个时间点血栓信号强度比的均数均高于对侧股动脉。　　 6.注射99mTc-DTPA-D-二聚体抗体后,5只大鼠ECT图像上各个时间点均未显示股动脉血栓核素的特异性浓聚。　　 7.大鼠尾静脉注射Gd-DTPA-D-二聚体抗体组,有4例确定有股动脉血栓,1例可疑有股动脉血栓；注射Gd-DTPA组,有2例确定有股动脉血栓,3例可疑有股动脉血栓；注射99mTc—DTPA-D-二聚体抗体组,5例均未见股动脉血栓显示,病理解剖结果显示每组5只大鼠股动脉均有血栓形成。　　 结论：　　 (1)99mTc-DTPA-D-二聚体抗体有比较高的纯度、稳定性,并具有免疫活性。　　 (2)用相似方法制备的Gd-DTPA-D-二聚体抗体具有免疫活性,也应具有较高的纯度和稳定性,为后续的免疫成像打下基础。　　 (3)本实验选择的建立大鼠股动脉血栓模型方法成功率高,为下一部分大鼠股动脉血栓免疫显像打下扎实基础。　　 (4)Gd-DTPA-D-二聚体抗体对于小动脉血栓的MR显像在本实验中优于常规造影剂Gd-DTPA。　　 (5)小动脉血栓利用Gd-DTPA-D-二聚体抗体的MRI靶向显像在本实验中优于99mTc-DTPA-D-二聚体抗体的ECT靶向显像。　　 (6)Gd-DTPA-D-二聚体抗体的MR靶向免疫成像对于显示小动脉血栓司能具有良好的应用前景。