BlyS(B lymphocyte Stimulator)是TNF超家族的一个成员,它在体内的过量表达与B细胞介导的自身免疫病有关,本实验旨在从BIyS免疫的小鼠的脾脏建立单链抗体(scFv即single chain variable fragment)库,从中筛选能抑制BlyS与其受体BCMA的结合的中和抗体。 从用BlyS免疫的小鼠的脾脏抽提RNA,然后反转录cDNA,再以此为范本PCR扩增抗体重链和轻链可变区,通过over-lap PCR得到scFv基因。将scFv用限制性内切酶sfiI酶切后克隆到同样用sfiI酶切的噬菌粒上(这样scFv就和噬菌粒上的M13噬菌体的基因Ⅲ蛋白融合,可以将scFv表达于噬菌体表面),将此噬菌粒电转到大肠杆菌XL1-Blue中,建立了免疫型的鼠源的噬菌体展示BlyS单链抗体(scFv)库。 用5μg/mlBlyS包被免疫管,经过五轮的Biopanning,与BlyS结合的抗体阳性率由第三轮的55%上升到第五轮的100%;第三、四、五轮的各20个克隆中经ELISA筛选得到的六个没有交叉反应的克隆(3-5、4-1、4-5、4-12、4-16、4-19),通过测序可进一步证实BlyS抗体的富集:4-1、4-5、4-12、4-16、4-19的重链序列完全相同,而3-5的序列与它们完全不同。 将3-5和4-16的scFv基因克隆到表达载体pTc上,在表达菌BL21(DE3)进行表达得到可溶性scFv。用可溶性scFv进行竞争ELISA和其中和活性的细胞学实验,结果表明3-5不论ELISA中还是在细胞学实验中都能抑制BlyS与其受体BCMA的结合,表现出其中和活性:而4-16的中和活性还有待进一步证实。