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第一部分:重组大鼠CD40基因真核表达载体的构建及功能鉴定目的:构建含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表达质粒。方法:从大鼠的脾脏组织中完整克隆出大鼠CD40基因全长,成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-CD40,通过脂质体介导转染COS7细胞,免疫双荧光法检测CD40的表达。结果:成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-CD40并转染COS7细胞,证明真核表达质粒pIRES2-EGFP-CD40在COS7细胞中能够稳定表达目的基因。结论:成功构建了含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表达质粒。第二部分:含pIRES2-EGFP-CD40质粒减毒沙门氏菌的构建及功能鉴定目的:构建含pIRES2-EGFP-CD40质粒的减毒沙门氏菌菌疫苗。方法:采用电转化法将pIRES2-EGFP-CD40质粒成功转入鼠伤寒沙门氏菌(LB5000),经过甲基化修饰后的pIRES2-EGFP-CD40质粒通过电转化转入终宿主菌SL3261,通过抗生素筛选法挑取单个菌落进行扩增,最终抽提质粒并进行PCR鉴定。结果:终宿主菌SL3261在电转化转入pIRES2-EGFP-CD40质粒后,通过质粒抽提和PCR鉴定证实,其所获得的目的条带与原转化质粒条带大小相同。结论:成功构建了能携带大鼠CD40基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-CD40的SL3261疫苗菌。第三部分:含pIRES2-EGFP-CD40质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响目的:探讨减毒沙门氏菌为载体的CD40基因疫苗对荷瘤大鼠免疫系统的影响及治疗大肠癌可行性。方法:雄性6-8周龄SD大鼠18只随机分为3组,分别为SL3261组、空质粒(pIRES2-EGFP)组以及CD40(pIRES2-EGFP-CD40)组。对全部大鼠应用1,2-二甲肼连续皮下注射18周以构建大鼠大肠癌实验模型,分别于第8周、第10周、第12周及第16周根据所分组别不同共四次灌服SL3261、pIRES2-EGFP/SL3261和pIRES2-EGFP-CD40/SL3261,于18周后处死全部实验大鼠,将大鼠瘤体解剖后观察并记录瘤体大小、瘤体数量、有无转移灶等,根据观察指标进行Dukes分期;流式细胞仪检测外周血和脾脏细胞表型,PHA刺激脾脏细胞72小时后培养上清中IFN-γ的含量通过ELISA法检测,脾脏细胞中GFP的转录表达通过RT-PCR进行检测。结果:CD40组平均成瘤数为5.8±2.2个,明显低于SL3261组的12.7±3.1和空质粒组的11.6±2.4(P<0.05),空质粒组和SL3261组两组的成瘤数相比较无明显统计学意义(P>0.05);脾脏细胞和外周血表型检测显示CD40组的活化T细胞CD3+CD8+数量较其它荷瘤组明显增高(P<0.05),PHA刺激脾细胞试验结果证实空质粒组和SL3261组分泌IFN-γ的能力也明显低于CD40组(P<0.05)。结论:携带重组质粒pIRES2-EGFP-CD40的减毒沙门氏菌可以在荷瘤大鼠体内实现转染CD40基因并有效高表达,能显著提高荷瘤大鼠的细胞免疫功能,最终对实验性大鼠大肠癌具有明显的抑制作用。