论文部分内容阅读
结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来的研究表明CRC的发生发展与肿瘤免疫与代谢重编程密切相关。我们前期研究CRC免疫逃逸机制的过程中,通过TCGA数据库分析发现B7-H3可能影响谷胱甘肽代谢通路中异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH1）的表达,B7-H3为B7/CD28免疫球蛋白超家族成员,IDH1参与多种代谢途径。目前认为在结直肠癌的发生与发展过程中肠道炎症导致肠道微生物失调,继而肿瘤免疫和代谢紊乱,影响结直肠癌的恶性进展与预后不良,因此我们计划探讨B7-H3和IDH1对CRC患者预后的价值,研究B7-H3、IDH1的作用机制。进一步分析B7-H3、IDH1不同表达的CRC患者之间差异性的肠道微生物构成丰度,作为判断患者预后的辅助指标。临床研究方面收集了2006-2012年间的CRC患者的福尔马林固定石蜡包埋标本（Formalin fixed paraffin-embedded,FFPE）制作组织芯片,根据免疫组化染色情况,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用Cox比例风险回归方法进行多因素生存分析,探讨B7-H3、IDH1与临床病理参数的关系以及对CRC患者的预后价值。细胞水平通过real-time PCR法和western blot法在B7-H3和IDH1的稳转株（SW480-NC,SW480-B7-H3;Caco-2-NC,Caco-2-shB7-H3以及SW480-NC,SW480-IDH1;HCT116-NC,HCT116-shIDH1）中检测B7-H3、IDH1、IDH1的上游转录因子SREBP1以及PI3K/Akt通路相关基因的表达,结合挽救实验验证B7-H3对IDH1的mRNA水平的影响;并在IDH1稳转株中通过细胞克隆形成实验和划痕实验验证IDH1对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。为进一步分析差异性的肠道微生物构成丰度,我们收集2018年手术后CRC患者的FFPE,根据免疫组化检测将患者分为B7-H3+IDH1-和B7-H3+IDH1+表达组;后收集到10例术后辅助化疗前患者的新鲜粪便样本,对肠道微生物进行测定,分析菌群构成丰度的差异,以此作为判断CRC患者预后的辅助指标。临床数据显示,IDH1的高表达与淋巴转移情况和TNM分期的相关性具有统计学意义（P=0.043,P=0.008）;B7-H3阳性表达的亚组中,IDH1高表达患者的中位生存时间为71.4个月,IDH1低表达的中位生存时间为87.3个月,IDH1高表达影响患者不良预后（log-rankχ2=6.411,P=0.036）;B7-H3和IDH1在CRC组织中的表达具有相关性（P=0.044）;多因素Cox回归分析显示B7-H3+IDH1+表达的CRC患者死亡风险更高（HR=1.760,95%CI=1.105-2.934,P=0.043）。细胞水平上发现,在B7-H3稳转株中,IDH1、SREBP1、p-Akt的表达水平与B7-H3表达水平变化一致;在IDH1稳转株中,IDH1的表达水平只与p-Akt的表达水平一致（P=0.038）,并影响肿瘤细胞的增殖和迁移;挽救实验中干扰B7-H3的mRNA表达水平后,IDH1的mRNA表达水平随之下降（P<0.001）。B7H3+IDH1-和B7-H3+IDH1+分组患者的肠道微生物中拟杆菌门（Bacteroidetes,36.96%vs 56.50%,P<0.05）、变形菌门（Proteobacteria,17.66%vs 6.87%,P<0.05）、普雷沃氏菌属-9（Prevotella9,1.33%vs 35.65%,P=0.008）、拟杆菌属（Bacteroides,25.31%vs 10.31%,P=0.016）表达丰度差异有统计学意义。B7-H3与IDH1在CRC患者的临床组织标本中联合表达提示预后不良。B7-H3介导SREBP1作用于IDH1,通过PI3K/Akt信号通路影响CRC细胞的增殖和迁移。B7-H3高表达的患者中,普雷沃氏菌属-9高丰度表达和拟杆菌属低丰度表达或可作为判断CRC患者预后不良的辅助指标。