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原发性肝癌(PHC)是一种高发性的恶性肿瘤,发病率居于全世界肿瘤发病率的第5位。PHC晚期患者的临床治疗一直是急待解决的难题。大量的研究资料表明已有的化疗方案疗效不甚理想、且毒性大,因而寻找治疗肝癌的新靶点已成为热点领域。环腺苷酸(cAMP)是多种激素、生长因子信号传导通路中的重要调节分子,与细胞的生长、分化、凋亡密切相关,但cAMP对肝癌细胞增殖的影响及其作用机制还研究的不多。本文以人肝癌BEL-7402细胞为模型,研究cAMP对肝癌细胞增殖的影响,并探讨其作用的分子机制,以期为肝癌治疗提供潜在的靶点。本研究获得的主要结果如下:
文献报道,cAMP类似物8-Br-cAMP、磷酸二酯酶抑制剂IBMX以及腺苷酸环化酶激活剂forskolin均能提高细胞内cAMP的水平。笔者发现forskolin与IBMX或8-Br-cAMP能时间和剂量依赖性地抑制肝癌细胞的增殖。
由激素、生长因子、细胞外基质等多种刺激因子激活的丝、苏氨酸蛋白激酶Akt(亦称作蛋白激酶B,PKB)和胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)是细胞生长、分化、增殖、凋亡等生理活动中的重要调节分子,在肿瘤形成与发展过程中起着重要作用。文献报道,cAMP主要通过抑制ERK1/2而抑制细胞增殖,而本文的结果显示forskolin和8-Br-cAMP在人肝癌BEL-7402细胞中不仅不能抑制FBS激活的ERK1/2,相反却能增强FBS对ERK1/2的激活作用;单独的forskolin和8-Br-cAMP也能升高细胞中ERK1/2的磷酸化水平。然而,FBS、insulin、EGF和IGF-1所激活的Akt却均能被forskolin和8-Br-cAMP抑制。Akt在肝癌细胞增殖中起着非常重要的作用。Akt活性被PI3K特异性抑制剂抑制时,细胞增殖也明显的被抑制。为确证cAMP是否通过抑制Akt活性而抑制肝癌细胞增殖,我们在细胞中转染了野生型HA-Akt和持续激活型HA-Myr-Akt质粒。HA-Akt对cAMP的抑制作用表现出与内源性Akt相似的生物学特性,cAMP能有效的抑制FBS所刺激的HA-Akt磷酸化,其抑制率达98.1%;但HA-Myr-Akt对cAMP相对耐受,cAMP对其的抑制率只有51.7%。BrdU掺入实验发现,cAMP能强烈地抑制转染HA-Akt质粒的细胞中由FBS刺激所引发的DNA的合成,其抑制率达到53.4±1.3%,却不能抑制转染HA-Myr-Akt质粒的细胞中DNA的合成,其抑制率只有8.9±2.9%,说明高Akt活性能逆转cAMP对BEL-7402细胞增殖的抑制作用,因而cAMP抑制细胞增殖是通过抑制Akt的活性实现的。
PKA特异性抑制剂H89能完全阻断BEL-7402细胞中cAMP对Akt的抑制作用,表明cAMP抑制Akt的活性由PKA所介导。我们还发现forskolin能明显抑制由FBS诱导的pEGFP-PDK-1由细胞质向细胞膜的转位,并且该作用也能被H89所阻断。虽然Akt的活化和PDK-1的转位都受PI3K激酶调节,但forskolin并不能抑制FBS诱导的PI3K激酶的活化,说明阻断FBS诱导的PDK-1膜转位而非抑制PI3K活性是cAMP抑制Akt活化的分子基础。
虽然Akt的主要功能是通过抑制促调亡蛋白BAD、caspase3、caspase9和P53等的活性而促进生长因子介导的细胞存活和抑制细胞的凋亡,但forskolin与8-Br-cAMP作用BEL-7402细胞48小时却并不能激活细胞中的caspase3和上调P53的表达。TUNEL染色细胞也不呈现凋亡细胞的黄绿色荧光,流式细胞仪检测也不出现凋亡细胞的“亚G1峰”。因而cAMP抑制肝癌细胞的增殖并不是通过诱导细胞凋亡而实现的。笔者还发现forskolin与8-Br-cAMP作用BEL-7402细胞48小时后,处于G0/G1期的细胞明显增多,而相应的分布于S期与G2/M期的细胞明显减少,因而cAMP通过诱导细胞周期阻滞而抑制肝癌细胞的增殖。当细胞中Akt的活性被LY294002和forskolin抑制时,由FBS诱导的p27kipl和p21cipl在进入S期时的降解也被抑制,细胞中的p27kipl和p21cipl会一直维持在较高水平。RT-PCR分析发现foskolin并不能升高细胞中p27kipl和p21cipl的mRNA水平。但是,forskolin能明显的抑制由FBS引起的p27kipl和p21cip1由细胞核向细胞质的转移和由EGF引起的p27kipl和p21cipl磷酸化。因而,cAMP通过抑制Akt的活性而抑制p27kipl和p21cipl磷酸化,阻断了在细胞进入S期时p27kipl和p21apl从细胞核向细胞质的转移,进而抑制它们在细胞质中降解,使得细胞核中p27kipl和p21cipl蛋白维持在较高水平而导致细胞周期阻滞于G0/G1期。
在BEL-7402细胞中,forskolin和8-Br-cAMP可呈时间和剂量依赖性刺激ERK1/2的磷酸化。HA-ERK1与野生型HA-Rap1、显性失活突变型HA-RapN17(dominant negative mutant)、持续激活型HA-Rap1-1G12V以及Rap1GTP酶HA-Rap1GAP共转染实验结果显示,升高细胞中Rap1的活性或抑制细胞中Rap1的活性都不会影响cAMP对HA-ERK1的活化。HA-ERK1与野生型His-Ras或显性失活突变型RasN17质粒共转染实验结果显示,升高细胞中的Ras蛋白的表达能明显促进cAMP对HA-ERK1的激活,而阻断Ras活化能明显地抑制cAMP刺激的HA-ERK1磷酸化。HA-ERK1与野生型Myc-Raf-1及HA-B-Raf共转染实验结果显示,高表达B-Raf而非Raf-1能明显的增强cAMP对HA-ERK1的活化。MEK1/2特异性抑制剂PD98059和PKA抑制剂H89都能阻断forskolin对ERK1/2活性的刺激作用。由此可见,cAMP通过激活PKA、Ras、B-Raf、MEK1/2,进而提高细胞中ERK1/2的磷酸化水平。笔者还发现,cAMP可下调BEL-7402细胞中甲胎蛋白AFP的表达和碱性磷酸酶ALP的活性,表明cAMP有促进肝癌细胞分化的作用,而该作用能被MEK1/2特异性抑制剂U0126所阻断。这些结果提示cAMP通过活化的ERK1/2而诱导了细胞的分化。
综上所述,cAMP通过抑制Akt的活性阻滞细胞周期蛋白激酶抑制因子p27kipl和p21cipl的转位和降解,从而抑制人肝癌BEL-7402细胞的增殖;另一方面,cAMP又能通过刺激ERK1/2磷酸化而诱导BEL-7402细胞的分化。