论文部分内容阅读
基于荧光共振能量传递(FRET)的生物均相检测简单、灵敏而深受关注。它常用有机染料和量子点(QDs)作为荧光标记。这些传统下转换材料在紫外光或蓝光的激发下,不可避免激发生物样品产生背景光而降低了检测灵敏度。在光动力治疗(PDT)领域,用紫外光或蓝光激发光敏剂,穿透深度浅,PDT效果差。上转换纳米晶(UCNPs)是解决上述难题一个好的选择。它是用低能量的近红外光激发产生高能量的上转换荧光,因此有较低的背景荧光和弱的光损伤,同时生物组织穿透深度大。UCNPs在基于FRET的均相检测和光动力治疗方面有巨大潜力。本论文开展了初步地工作,结果如下:(1)为了解决上转换纳米晶(UCNPs)生物功能化难的问题,水热和共沉淀相结合制备了NaYF4:Yb3+, Er3+ UCNPs,并包覆二氧化硅壳层。SEM表征包覆前后分别为25 nm和250 nm的单分散粒子。在980nm激光照射下, UCNPs的PBS溶液呈明亮的绿光。荧光光谱和寿命均表明二氧化硅壳层对其发光性质影响很小。圆二色谱表征UCNPs偶联抗体后,抗体二级结构几乎不变。荧光免疫识别的结果进一步验证了UCNPs偶联抗体具有生物的特异性。(2)相转移得到了小粒径、表面带有氨基基团的水溶性UCNPs,其亲合素化后和生物素化的藻红蛋白构成FRET体系。以生物素检测的实验为例说明这种设计可用于生物分子的定量分析。(3)在UCNPs为供体的FRET均相检测体系中,弱的供体光强度使FRET信号难于检测,同时生物自发荧光也会产生干扰。为了解决这个问题, 800 nm处有强近红外光的NaYF4:Yb3+,Tm3+ UCNPs作为供体,在784 nm处有表面等离子共振吸收带的金纳米粒子(GNPs)作为受体构建了新型的FRET体系。当体系中加入单纯human IgG,竞争性地争夺与goat antihuman IgG结合位点,破坏FRET。这种荧光信号的变化可用于human IgG的检测。(4)在基于FRET均相检测中,如果用QDs作为受体,其较大消光系数、宽吸收光谱的特点会增大F?rster半径,提高能量传递的效率。然而宽的吸收光谱同时也引起QDs受体的直接激发。长寿命的镧系荧光标记物作供体的时间分辨的技术虽然可以解决这个问题,但实验本身过于复杂,仪器昂贵。本文用UCNPs作为供体、QDs作受体,构建了一个新型的FRET均相检测体系。由于受体QDs不吸收UCNPs供体的近红外激发光,信号的获得不再需要时间分辨技术。(5)尽管基于FRET的QDs标记适配子荧光探针是当前研究的热点,但光激活下QDs产生的活性氧会破坏适配子。本实验利用光稳定性更强UCNPs替代QDs设计了新型的适配子荧光探针。硝基四唑氮蓝(NBT)实验表明在光激发下,UCNPs几乎不产生活性氧。一个模式的ATP检测验证了这种设计的可行性。(6)由于近红外光有强的生物组织穿透性, UCNPs经过二氧化硅包覆掺杂光敏剂后,可用于深层组织的PDT。然而均一薄层二氧化硅的包覆技术难于控制。我们通过简单共价偶联的方式构建了UCNPs藻红蛋白复合体(UCNPs_RPE)作为光敏药物。在红外光的作用下,UCNPs通过FRET敏化藻红蛋白产生单态氧。UCNPs_RPE对H22肝癌细胞明显的抑制效果表明它可能为PDT提供一种新的途径。