背景:肝癌,作为一种高发病率,高死亡率的消化系统肿瘤,严重影响了大多数患者的生活质量。随着新药的不断出现,肝癌的治疗虽然取得了长足的进展,但其预后仍较差,5年生存率仅约10%。肝癌难以通过早期检查发现,且患病早期病患多无明显症状,多数病人就诊时已属晚期,失去手术彻底根治机会。肝癌的复发转移率高是肝癌预后效果差的主要原因,肝癌转移是一个多因素的复杂过程,其过程最主要包含上皮细胞极性转变、肿瘤细胞间黏附变化,运动能力加强,穿透基底膜,血管生成等。已有研究证明多种粘附分子、基质金属蛋白酶、细胞因子及其所参与的信号转导、癌基因和抑癌基因的表达和调控的改变均涉及到肝癌转移的过程。上皮-间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下,具有极性的上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、在细胞基质中自由移动的间质细胞的过程。在肿瘤的发展中,上皮-间质转化令原本不具有迁徙及侵袭能力的细胞获得浸润能力,并最终转移到其他组织和器官,从而使肿瘤形成局部浸润和远端转移,并再次通过间质-上皮转化定植于转移灶。Wnt/β-catenin信号通路被证明多种关键的不可忽略的调节作用,尤其在骨骼发生、发育与再生的各个阶段,Wnt信号通路扮演着十分活跃的角色。有研究表明,上调的β-catenin将进人细胞核与TCF/LEF信号通路发生作用,激活下游众多的靶基因过度表达,与EMT的发生有直接关联。糖原合成酶激酶-3β是Wnt/β-catenin信号通路的组成因子之一。有研究表明,GSK-3β可通过降解β-catenin抑制肿瘤生长,并通过抑制Wnt通路调节肿瘤细胞死亡增殖和凋亡。而BIRC5被普遍认为是Wnt/β-catenin的靶基因之一。生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族 IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)中抗凋亡作用最强,但结构最简单的蛋白。其基因BIRC5位于17q25,长14.7 kb,具有3个内含子及4个外显子,含有一个杆状病毒IAPs的重复序列。BIRC5在胎儿组织和各种人类恶性肿瘤组织中大量表达,但在正常组织或分化良好的成人组织中无表达。既往研究发现,BIRC5基因在肝癌中高表达,并且和肝癌患者不良的预后相关。敲低BIRC5基因会抑制肿瘤细胞的增殖,促进凋亡。miR-218已证实是DNA损伤修复基因,是核苷酸切除修复(NER)途径的限速酶,NER是DNA修复通路之一。NER可以识别修复紫外线损伤的及化学药物损伤的DNA双链螺旋结构。NER通过解开受损部分DNA的双螺旋结构,切除受损部分,重新合成受损部分使其连接于未受损的DNA结构上。研究发现BIRC5基因的mRNA可编码由297个氨基酸组成的蛋白质,其具有核苷酸切除修复的作用。基因BIRC5的表达与DNA的修复酶缺乏基因形成紧密的异二聚体存在,在核苷酸切除修复途径中作为一个整体,具有切除DNA 5’端和识别损伤的双向作用,同时还具有5’-3’核苷酸内切酶活性,在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用,而核苷酸切除修复过程需要miR-218的参与。目的:本课题针对我国人群,采用病例对照研究方法,分析我国肝癌的发病相关危险因素,采用分子生物学和传统的流行病学方法相结合,研究BIRC5基因型在肝癌中的分布,并在分子水平上研究miR-218靶向BIRC5并调节GSK-3 β/β-catenin通路对肝癌细胞侵袭转移能力及其他恶性生物学特征的影响。方法:本研究选取2014年1月-2016年12月在山东省立医院住院的204例肝癌患者作为研究对象,年龄在37-78岁范围;所有参与者均获取知情同意并签字。通过MassARRAY技术检测BIRC5基因的SNP位点,并对miR-218靶向蛋白BIRC5与肝癌患病风险进行相关性分析。通过miR-218模拟物(mimic)和阻遏物(inhibitor)转染构建相关细胞系并通过qPCR检测miR-218的表达。经转染后,通过双荧光素酶报告实验证明了 BIRC5与miR-218之间的靶标关系,并通过Western Blot检测EMT相关标志物的蛋白水平。细胞克隆形成实验检测了miR-218是否影响HepG2细胞的克隆形成能力,Transwell小室实验检测了各转染组细胞的侵袭转移情况,CCK8检测miR-218是否影响HepG2细胞的增殖能力,流式凋亡检测方法及免疫荧光实验检测miR-218是否影响HepG2细胞的凋亡,并进一步通过Western blot研究了 miR-218对GSK-3β/β-catenin通路的调控作用。同时,通过裸鼠成瘤实验及HE染色验证了 miR-218对肝癌瘤体的抑制作用。结果:1.BIRC5 rs3212986rs2298881,rs1 1615 和 rs6498486 基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律(P>0.05),其SNP中的MAF与NCBI中的dbSNP数据库中所描述的普通中国人特征类似,并且SNP的MAF均大于10%。而rs2276466不符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律(P=0.02)。2.分析发现BIRC5 rs3212986与GG基因型比较,TT基因型和T等位基因肝癌发病风险略微增高(95%CIs 为 1.93(0.96-3.94)与 1.49(0.95-2.13),BIRC5 rs11615 TT和T等位基因肝癌发病风险增高(95%CIs为1.59(0.96-2.98)和1.42(0.97-2.26)。3.BIRC5的rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。4.提取志愿者的肝癌及癌旁组织,结果显示,癌旁组织中niR-218的表达明显较高,而BIRC5的表达较低。与癌旁组织相比,miR-218的表达在不同分期肝癌组织中均明显下降,而BIRC5的表达则均明显上升,且分期越晚,癌组织中的miR-218及BIRC5与癌旁组织的表达差异越大。5.双荧光素酶实验的结果显示,当HepG2细胞转染了克隆有BIRC5 3’-UTR载体质粒后,miR-218过表达组荧光素酶活性明显受到抑制,与对照组相比较差异明显。而转染克隆有BIRC5 3’-UTR突变型载体质粒后,miR-218组荧光素酶的活性值之间无明显差异。同时,BIRC5的蛋白表达水平也通过Western blot进行检测。结果显示,与空白对照组相比,BIRC5在miR-218过表达组的表达明显降低,在miR-218 inhibitor组的表达明显升高,而miR-218 overexpression NC及miR-218 interference NC之间的BIRC5含量差异无统计学意义,因此证明了BIRC5与miR-218之间的靶标关系。6.HepG2组中肉眼可见明显克隆集落,克隆形成率为59±5.568%。与对照组相比,miR-218过表达时克隆集落数量明显减少,克隆形成率为47.67±4.163%,而miR-218 inhibitor组中克隆集落明显增多,克隆形成率为76.67±4.726%。由此可知,靶向BIRC5的miR-218抑制了 HepG2细胞的克隆形成能力(p=0.0038)。7.Transwell小室实验中,对照组中可见一定数量的侵袭及转移细胞,与对照组相比,转染miR-218 mimic的细胞的侵袭及转移均受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义(p=0.0032)。8.转染 miR-218 mimic 后抑制细胞 EMT 的转化,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达下调,而E-cadherin的表达上调。与此同时miR-218 inhibitor组,由于干扰了 miR-218在细胞中的表达,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达上调,E-cadherin的表达上调。(p<0.05)9.采用CCK8实验检测各转染组细胞的增殖情况。与microRNA对照组相比,转染针对BIRC5的miR-218组的细胞的生长受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义(p=0.0002)。10.采用流式细胞仪验证HepG2细胞凋亡,以此探讨靶向BIRC5的miR-218是否可以诱导了 HepG2细胞的凋亡。对照组中HepG2细胞凋亡比率为9.64±0.59%,miR-218mimic组的细胞凋亡数明显增加,其比例达到20.52±0.58%。同时,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡减少至5.6±0.63%,相比对照组,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡明显减少。同时,通过免疫荧光染色检测了细胞凋亡相关因子caspase3及caspase6的表达,与对照相比,靶向BIRC5的miR-218 caspase-3及caspase6的表达明显上升。11.与HepG2组相比,miR-218过表达后G1期比例明显上升,S期细胞显著下降,而miR-218 inhibitor组中G1期比例明显下降,S期细胞也有上升的趋势。(p=0.0101)。而G2期的比例变化无统计学意义。12.通过Western blot检测Wnt/β-catenin通路中沿路分子的蛋白表达。经检测发现,当miR-218过表达时,BIRC5表达下降,同时GSK-3β的磷酸化表达下降,TCF7、LEF1及β-catenin的表达均有明显下降(p=0.0023),而Wnt3a,Dvl,GSK-3β的表达变化无统计学意义。13.在BALB/c-nu小鼠皮下成瘤实验8周后,可明显发现实验组(注射miR-218 mimic质粒转染后的HepG 2细胞株)所生成瘤体长径、短径、重量、体积均明显小于对照组(注射HepG 2细胞株)所生成的瘤体。进一步通过HE染色观察可发现,对照组肿瘤组织体积较大,有小片坏死区域,肿瘤细胞生长旺盛,细胞核异型性明显,间质血管丰富,而实验组的肿瘤切片坏死区域明显增大,间质血管稀少,可见明显纤维化形成,肿瘤细胞生长受到明显抑制。BIRC5的免疫组化证明,BIRC5表达于HepG2细胞质内,对照组中BIRC5表达较高,而miR-218 mimic质粒的转染明显抑制了 BIRC5的表达。14.肝癌细胞系中的miR-218能靶向BIRC5,高表达的miR-218通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,抑制肝癌细胞株HepG2中EMT相关基因Vimentin、β-catenin及N-cadherin的表达并上调E-cadherin表达,抑制钙黏蛋白转换的过程,以此抑制了 EMT的发生。同时,高表达的miR-218通过下调BIRC5抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡。结论:在中国人群中BIRC5 rs3212986和rs11615基因多态性与肝癌发病风险有相关性。rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。miR-218可能通过抑制BIRC5基因转录活性,并通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,下调β-catenin表达,从而抑制HepG2细胞株的侵袭转移能力并抑制EMT的发生发展过程,抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡,以此抑制肝癌的发生和发展。