随着世界经济发展和温室气体排放,全球气温上升,极端天气频繁发生。干旱、高温、水淹、冷害对农作物生产造成了严重的威胁。水稻(Oryza sativa L.)是我国主要的粮食作物,保障水稻的高产稳产对我国的粮食安全具有重要意义。水稻生产从播种到收获,极易遭受干旱、高温等恶劣气候的影响。目前植物很多抗逆相关基因已被克隆鉴定,但在抗旱、耐高温等性状上效应较低,单个基因在农业育种中的应用报道还相当少。因此,需要进一步发掘抗逆相关基因,以期为深入了解水稻的抗逆机制打下基础。基于前期基础,本研究对两个与逆境相关的基因功能进行了深入研究,一个为AP2/ERF转录因子家族的基因OsEBP89,另一个为具有锌指结构域的E3泛素连接酶基因OsRMT1。OsEBP89来自于OsSn RK1的互作网络图谱;OsRMT1来源于本实验室前期利用IRAT109和珍汕97B重组自交系群体定位的位于第4号染色体的抗旱QTL(quantitative trait locus)区间内候选基因。本研究通过对OsEBP89和OsRMT1两个抗逆相关基因功能的评价,加深了对水稻抵御非生物逆境作用机制的理解,为水稻抗逆育种提供了理论基础和基因资源。具体研究结果如下:1.在不同时期的组织表达模式的实时荧光定量PCR分析显示,OsEBP89基因具有时空表达特异性,苗期在根中表达量最高,叶片和茎中表达量相对较低;开花期,根和茎中的表达水平明显升高。20%PEG6000(聚乙二醇)和100μM ABA(脱落酸)处理会抑制OsEBP89基因的表达,而乙烯处理和水淹胁迫会诱导该基因的表达。GFP融合蛋白的亚细胞定位试验表明该蛋白位于细胞核。为了全面研究OsEBP89基因功能,构建了基因过表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化日本晴获得26株过表达植株和3株纯合突变植株。2.分别在萌发期和苗期对OsEBP89转基因水稻进行200 m M甘露醇、20%PEG6000渗透胁迫处理,在孕穗期干旱胁迫处理,结果显示OsEBP89敲除突变体的耐渗透胁迫能力和抗旱性优于对照,而过表达植株表现相反。3.用20%PEG6000处理OsEBP89转基因材料三叶期秧苗,发现敲除突变体叶片中H2O2和MDA含量低于对照,而Pro含量和SOD酶活性高于对照,表明敲除突变体的渗透保护物质含量和ROS清除能力显著高于对照,其体内氧化水平以及膜脂损伤程度均低于对照。测定孕穗期的离体叶片失水速率,结果显示过表达植株的失水速率高于对照和突变体植株。4.OsEBP89敲除突变体和野生型植株苗期经20%PEG6000处理前后样品的转录组分析表明,有4个GO(Gene Ontology)条目与逆境胁迫响应相关,分别为response to stress,oxidation reduction,response to water,response to stimulus。从这4个GO条目中选取了8个候选基因,分别是Os03g0285700(OsAPX1),Os03g0358100(glutathione peroxidase),Os02g0527300(OsHsf A3),Os04g0423400(OsASR2),Os05g0211100,(OsCYP51G3),Os05g0455500(OsP5CS),Os01g0256500(SAGENE21),Os08g0120600(fructose-bisphospate aldolase isozyme)。基因的启动子分析结果显示SAG21和ARG2启动子区存在GCC box元件,OsP5CS和OsHsf A3启动子区存在GCC-box和GCC-like box元件,表明这4个基因可能是OsEBP89转录因子直接调控的下游靶基因。5.对OsEBP89转基因材料进行水淹试验表明,突变体植株的萌发率在淹水4 d时高于对照和过表达株系,7 d后突变体植株芽长显著长于对照和超表达植株,表明OsEBP89负调控水稻耐淹能力。6.将缺失不同结构域的OsEBP89蛋白突变体分别与Sn RK1蛋白进行酵母双杂交分析,结果显示仅全长蛋白能与OsSn RK1发生互作,表明OsEBP89需要完整的结构才能实现与OsSn RK1的互作;体外pull down以及双分子荧光素酶互补实验进一步表明OsEBP89与OsSn RK1在体内外均能互作;体外磷酸化实验发现OsSn RK1蛋白激酶能够磷酸化修饰OsEBP89转录因子。7.在已有超表达和抑制表达转基因OsRMT1材料的基础上,构建CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体,转化水稻品种日本晴,获得了3株纯合突变植株。8.OsRMT1受高温和盐胁迫诱导表达。OsRMT1过表达植株耐高温性和耐盐性增强,而抑制表达植株耐高温性和耐盐性下降。敲除突变体较抑制表达株系存活率更低,表明OsRMT1正调控水稻抗非生物胁迫性。在苗期用45℃高温胁迫1d后,野生型和敲除突变体材料ABA含量没有显著差异,而突变体JA含量显著高于野生型。9.将OsRMT1基因融合到p GBKT7-BD载体中,构建BD::OsRMT1融合表达载体,对水稻叶片来源的c DNA文库进行筛选,获得了6个互作蛋白,利用烟草叶片细胞中双分子荧光素酶互补实验进一步表明OsRMT1在植物细胞内能与这6个蛋白与互作。这6个基因分别为Os03g0390900(expressed protein),Os04g0376700(ER lumen protein retaining receptor),Os04g0650000(oryzain alpha chain precursor),Os08g0104600(2Fe-2S iron-sulfur cluster binding domain containing protein),Os10g0419500(1,2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentene dioxygenase protein),Os11g0128800(高丝氨酸脱氢酶)。在45℃高温胁迫下反转录定量PCR分析表明4个基因受高温诱导表达,但另外2个受高温抑制表达。亚细胞定位显示以上6个互作蛋白均位于细胞核和细胞质中,与OsRMT1亚细胞定位相同。