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研究背景:溺水事故常有发生,据全球统计,每年因海水淹溺导致的死亡总数达到14万人。当海水进入肺内,肺泡膜上皮屏障遭到破坏,蛋白渗出充满肺泡腔,引起肺水肿,气体交换障碍,导致呼吸衰竭,甚至死亡,这是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的生理特性。目前除了保守对症支持治疗,ARDS没有有效的治疗策略。然而近来的研究显示,间充质干细胞移植为减少ARDS的死亡率提供了一种可能途径。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属多能干细胞,具有多向分化潜能。有报道其能够分化成肺泡上皮细胞,促进上皮再生,减轻炎症,改善病理损伤,甚至减少急性肺损伤(acute lung injury,ALI)模型死亡率。然而,由于MSCs在ALI肺组织模型的低移植率和低分化率,导致治疗效果不佳。因此,阐明MSCs对受损肺泡上皮细胞的修复机制,通过改善干细胞在受损肺组织定殖和分化,为改善MSCs对ALI模型的治疗提供理论依据。最近的一些研究表明,经典Wnt通路及其下游信号分子对MSCs的自我更新和分化起着至关重要的作用,在体外实验中证实激活经典Wnt/β-catenin通路能够促进大鼠MSCs分化成II型肺泡上皮细胞,不仅具有抗氧化功能,还能够促进自身向受损肺组织定殖。然而体内环境十分复杂,与体外环境不同,会影响MSCs的定殖与分化。一项近期研究显示,过表达β-catenin的慢病毒载体稳定转染的大鼠MSCs,通过激活Wnt/β-catenin信号通路,调节大鼠MSCs迁移、增殖、分化,达到改善MSCs治疗效果的目的,为本治疗海水淹溺肺损伤提供了一个可能的研究方向。实验目的:1.大鼠骨髓来源的间充质干细胞分离培养及鉴定;构建过表达β-catenin的慢病毒载体并建立大鼠MSCs稳转细胞株。2.过表达β-catenin的MSCs对损伤的肺泡上皮细胞的修复作用,以及在治疗海水吸入型肺损伤(seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI)大鼠模型的疗效研究。试验方法:实验一:MSCs培养鉴定:4周龄雄性SD大鼠骨髓提取MSCs,培养于L-DMEM培养基中,消化、传代后MSCs通过对形态学、流式细胞检测和多向分化能力进行鉴定。慢病毒载体(EF1α-MCS-3FLAG-CMV-EGFP-T2A-Puromycin)的构建和包装。MSCs培养和转染:MSCs(2×105/孔)接种于六孔板过夜培养,慢病毒转染。转染慢病毒载体的MSCs表达稳定性和转染效率检测:Q-PCR检测Ctnnb1 mRNA表达量,Western Blot检测β-catenin蛋白表达量验证转染是否有效及长期稳定。实验二:雄性SD大鼠36只随机分为四组(每组9只):),分别为:空白对照组、SWI-ALI模型组、MSCs治疗组、MSCs-Ctnnb1治疗组。造模后4小时各组肺组织标本进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin and eosin staining,HE staining)行病理组织学检查评估肺损伤。肺湿干重比、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白(total protein,TP)浓度、Occludin蛋白表达量检测评估肺上皮细胞通透性。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测促炎因子IL-1β、IL–6,抗炎因子IL–10评估肺部炎症。NIR815染料标记对照组MSCs和过表达组MSCs-Ctnnb1干细胞,注入两组SWI-ALI大鼠模型气道,分别在干预后12、48小时行体外近红外光谱肺部成像对比干细胞定殖效果。最后进行数据统计分析。实验结果:实验一:1.MSCs的鉴定:(1)具有贴壁特性,形态学观察以梭形细胞为主,呈涡旋状排列的细胞集落,四五天可传代1次,可连续稳定传代十代以上。(2)流式细胞仪检测结果:表面分子标志物:CD90和CD29的阳性表达率分别为99.3%和96.1%;CD45和CD34的表达率分别为0.087%和0.145%。(3)多向分化能力:MSCs成脂诱导后经油红O染色阳性;MSCs成骨诱导后茜素红染色阳性。2.构建活化β-catenin的慢病毒稳转大鼠MSCs细胞株:培养至第10代,通过荧光显微镜观察检测转染有目的基因的MSCs表达感染效率仍大于90%。Q-PCR检测结果显示:Ctnnb1 mRNA表达量在MSCs-Ctnnb1株明显高于MSCs-GFP株(P<0.01,n=9)。β-catenin蛋白表达量通过Western Blot检测也获得了相似的结果。实验二:1.病理损伤评估:海水吸入型肺损伤大鼠肺组织标本经苏木精-伊红染色镜下观察到肺泡壁增厚,肺泡间质炎性浸润,肺泡充血、水肿。这些组织病理学特征在MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组海水干预后4小时比SWI-ALI模型组明显缓解。MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组病理改善效果更好。2.肺上皮通透性评估:海水干预后4小时MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组比SWI-ALI模型组W/D比、BALF中TP浓度明显降低(P<0.05,n=9)。MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组总蛋白浓度降低效果更显著(P<0.05,n=9)。Western Blot结果显示Occludin蛋白表达量在MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组比SWI-ALI模型组表达量高(P<0.05,n=9),并且MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组表达量更高(P<0.05,n=9)。3.炎症评估:海水吸入后4小时SWI-ALI模型组比空白对照组BALF中IL-1β、IL-6和IL-10含量显著增加(P<0.05,n=9)。MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组比SWI-ALI模型组IL-1β、IL-6含量降低(P<0.05,n=9),IL–10含量增加(P<0.05,n=9)。MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组IL-1β含量降低、IL–10含量增加更显著(P<0.05,n=9)。4.MSCs在肺内定殖:MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组大鼠在海水干预后12小时和48小时肺组织进行体外近红外光谱成像追踪肺内MSCs,MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组海水干预后12小时和48小时荧光信号表达更强,定殖效果更好。结论:通过β-catenin过表达激活经典Wnt/β-catenin通路提高间充质干细胞的增殖及向受损肺组织的迁移能力,增加MSCs在肺内的定殖、缓解病理损伤、改善肺上皮通透性、减轻急性肺部炎症,能够提高MSCs对SWI-ALI的治疗效果。