目的:急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）的一个亚型,APL出现特异的染色体和基因改变,即伴有t（15;17）（q22;q21）,形成PML/RARα融合基因,这是APL发病及应用全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）和亚砷酸（arsenic trioxide, As₂O₃）治疗有效的分子基础,其疗效已得到国内外的公认。CD44是一种广泛分布的细胞表面跨膜糖蛋白,属于粘附分子家族,可通过选择性表达不同的外显子形成多种同源异构体,即标准型（CD44s）与变异型（CD44v）。CD44高表达于所有AML亚型原始细胞上[1]。应用CD44单克隆抗体能够不同程度的抑制多种髓系白血病细胞株的増殖并诱导细胞分化或凋亡[2]。有报道AML患者的骨髓及外周血中检测到了CD44v3、CD44v6及CD44v10等的高表达。CD11b是粘附分子整合素家族成员之一,它主要在成熟单核细胞、自然杀伤细胞、粒细胞上表达,属髓系相关分化抗原,是APL细胞向成熟分化的重要分子标志。PML/RARα融合基因是APL特异的基因异常改变,随着APL向成熟粒细胞分化或凋亡,其表达逐渐减弱,可作为APL预后和疗效的判断标准之一。本研究采用ATRA、As₂O₃作用于人APL细胞株NB4细胞,通过光学显微镜观察细胞形态、MTT法观察细胞生长抑制状况、流式细胞术检测细胞分化及凋亡、并应用RQ-PCR法检测ATRA、As₂O₃作用前后NB4细胞CD44v3、CD44v6及CD44v10及PML/RARαmRNA表达水平的变化。旨在探讨诱导APL细胞分化或凋亡过程中不同CD44v分子和PML/RARα表达的变化,及二者的相互关系,为CD44v作为白血病诊断、疗效判断及预后指标提供理论依据。方法:体外培养人APL细胞株NB4细胞,分别用ATRA（1μmol/L）、As₂O₃ （1μmol/L）、ATRA+As₂O₃（1μmol/L+1μmol/L）进行干预,应用MTT比色法检测细胞生长;用流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）分析以上药物对细胞分化的影响;AnnexinV-FITC/PI双标法检测上述药物对NB4细胞凋亡的影响;应用RQ-PCR法检测细胞中PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表达水平变化。所得结果运用SPSS13.0统计软件包处理,以α=0.05为显著性检验水准。结果:1 ATRA、As₂O₃作用下NB4细胞的形态学改变:NB4细胞株具有急性早幼粒白血病细胞的典型形态,胞浆充满颗粒,核膜略凹陷,有空泡。Wright’s-Giemsa染色光镜下观察:经ATRA作用后NB4细胞体积变小、核浆比例缩小、染色质变粗糙、核仁消失;核形态不规则,呈肾形、杆状及分叶核。As₂O₃作用于NB4细胞后表现为细胞体积缩小,细胞膜完整,胞浆中出现空泡,核染色质浓缩、碎裂成块弥散在胞浆中,并可见膜结构包裹的凋亡小体。2 ATRA、As₂O₃对NB4细胞的增殖抑制作用:ATRA作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后生长抑制率分别为（1.75±1.47）%、（2.91±1.94）%、（7.80±0.56）%、（14.5±4.84）%;As₂O₃作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后生长抑制率分别为（3.31±1.02）%、（6.41±0.74）%、（9.43±1.92）%、（20.59±3.88）%;ATRA+As₂O₃作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后生长抑制率分别为（2.56±1.43）%、（16.45±2.51）%、（20.5±2.56）%、（32.45±2.07）%;统计学分析显示,ATRA、As₂O₃及二者联用对NB4细胞均有增殖抑制作用,随时间延长,生长抑制率明显增加,各个时间点间比较,除ATRA组24h与48h之间无统计学差异（P>0.05）之外,其他时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）;同一时间点,各个处理组之间比较,24h各处理组之间无统计学差异（P>0.05）,48h与96h各处理组之间均有统计学差异（P<0.05）,生长抑制率As₂O₃+ATRA组大于As₂O₃组,大于ATRA组;72h As₂O₃+ATRA大于As₂O₃组和ATRA组,而As₂O₃组和ATRA组之间无统计学差异（P>0.05）。3 ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃对NB4细胞表面CD11b抗原表达的影响:ATRA作用于NB4细胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表达分别为（32.47±2.95）%、（84.93±1.45）%、（90.9±0.35）%;As₂O₃作用于NB4细胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表达分别为（10.97±1.33）%、（15.7±0.87）%、（18.9±0.30）%;ATRA+As₂O₃作用于NB4细胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表达分别为（18.57±0.65）%、（21.17±0.65）%、（26.53±0.83）%。统计学分析显示:各个处理组随时间延长,CD11b表达逐渐增多,各个时间点之间有显著性差异（P<0.05）;同一时间点,各处理组间比较,CD11b的表达ATRA组大于ATRA+As₂O₃组,大于As₂O₃组,均高于空白对照组,有统计学差异（P<0.05）。4 As₂O₃、ATRA+As₂O₃对NB4细胞凋亡的影响:ATRA作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分别为（0.57±0.06）%、（0.90±0.20）%、（1.07±0.35）%、（1.20±0.30）%;As₂O₃作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分别为（9.53±0.59）%、（13.77±0.70）%、（18.27±0.35）%、（16.23±1.15）%;ATRA+As₂O₃作用于NB4细胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分别为（2.27±0.32）%、（3.93±0.25）%、（7.83±0.40）%、（9.00±0.75）%。经单因素方差分析,在对照组中4个时间点测得的早期、中晚期和总凋亡率无统计学差异（P>0.05）,说明自然凋亡对本实验研究的其他统计结果没有影响。各个时间点ATRA组与对照组早期凋亡率无统计学差异（P>0.05）,24h⁷2h ATRA组与对照组中晚期凋亡率无统计学差异（P>0.05）,96h差异有统计学意义（P<0.05）。As₂O₃作用24h细胞早期凋亡率较高,而在As₂O₃作用48h以后细胞以中晚期凋亡为主。24h、48h、72h As₂O₃处理的NB4细胞随时间延长,早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率均明显增高,呈时间依赖性,96h较72h早期凋亡率降低,总凋亡率无统计学差异（P>0.05）。各个时间点As₂O₃组凋亡率均高于其他各组,有统计学差异（P<0.05）。5 ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃对NB4细胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表达水平的影响:RQ-PCR检测结果显示,以各组各指标空白对照组RQ值为1,ATRA作用于NB4细胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分别为:0.4867±0.0040、0.2380±0.0056、0.2137±0.0061;CD44v3的RQ值分别为:0.6437±0.0042、0.6263±0.0047、0.4020±0.0030;CD44v6的RQ值分别为:0.8370±0.0040、0.5417±0.0040、0.4263±0.0051;CD44v10的RQ值分别为:0.4940±0.0026、0.3780±0.0030、0.2643±0.0067;As₂O₃作用于NB4细胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分别为:0.3180±0.0027、0.3030±0.0040、0.2863±0.0047;CD44v3的RQ值分别为:0.6527±0.0045、0.4957±0.0057、0.2223±0.0035;CD44v6的RQ值分别为:0.5817±0.0047、0.5343±0.0042、0.4617±0.0038;CD44v10的RQ值分别为: 0.5263±0.0045、0.2490±0.0036、0.3347±0.0040;ATRA+ As₂O₃作用于NB4细胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分别为:0.6983±0.0025、0.2717±0.0035、0.1910±0.0036;CD44v3的RQ值分别为:0.4543±0.0047、0.4127±0.0040、0.1980±0.0070;CD44v6的RQ值分别为:0.5027±0.0040、0.3230±0.0020、0.2787±0.0020;CD44v10的RQ值分别为:0.4657±0.0035、0.4260±0.0598、0.1487±0.0035;统计学分析显示:除ATRA+As₂O₃组48h与72h之间CD44v10的表达无统计学差异（P>0.05）外,各处理组随时间延长上述各指标的表达均呈递减趋势,且各时间点之间有统计学差异（P<0.05）。同一时间点,不同处理组之间上述各个指标下降趋势经统计学分析得出:除72h经ATRA和ATRA+As₂O₃作用前后CD44v10的变化无统计学差异（P>0.05）外,其他各组均可得出各个时间点的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表达经ATRA+As₂O₃作用后下降最明显,差异有统计学意义（P<0.05）。经绘制散点图并应用直线相关分析得出:经ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃作用前后,随时间延长,PML/RARα与CD44v6的变化趋势均呈正相关,相关系数分别为r=0.98（P<0.01）、r=0.951（P<0.01）、r=0.999（P<0.01）;As₂O₃作用前后,随时间延长,PML/RARα与CD44v3的变化趋势呈正相关,r=0.965（P<0.01）,其他各组之间无直线相关关系。结论: 1 ATRA、As₂O₃及二者联用对NB4细胞具有增殖抑制作用,随时间延长,生长抑制率明显增加;同一时间点,各个处理组之间比较,48h、72h和96h As₂O₃+ATRA组生长抑制率均高于As₂O₃组和ATRA组。2 ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃可诱导NB4细胞表面CD11b的表达增加,且随作用时间延长表达逐渐增加;同一时间点,各处理组间比较,ATRA组处理的NB4细胞CD11b的表达明显高于ATRA+As₂O₃组和As₂O₃组。3 As₂O₃、ATRA+As₂O₃可诱导NB4细胞凋亡。随时间延长,凋亡细胞数增多,呈时间依赖性。As₂O₃作用24h细胞早期凋亡率较高,48h以后细胞以中晚期凋亡为主。各个时间点不同处理组之间As₂O₃处理的NB4细胞早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率均明显高于其他各组。4 ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃可使NB4细胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表达下降,呈时间依赖性。ATRA+As₂O₃作用于NB4细胞后各时间点的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表达下降明显高于其他处理组。经ATRA、As₂O₃、ATRA+As₂O₃作用后,随时间延长,PML/RARα与CD44v6的变化趋势均呈正相关。PML/RARα与CD44v3的变化趋势呈正相关。5 CD44v3、CD44v6有可能成为APL疗效观察及预后判断的又一临床检验指标。