噬菌体展示技术筛选灵芝8蛋白配体短肽及其活性检测

来源 :长春理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hexin123456789
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灵芝自古便是中国传统医学中的珍贵药材,具有滋补强身、扶正固本之效。在灵芝中提取的一些小分子物质如蛋白质,多糖等也有着免疫调节、抗肿瘤等功效。灵芝蛋白-8(LZ-8)是从灵芝菌丝体中提取出的一种真菌免疫调节蛋白。它的结构与功能与免疫球蛋白相似,具有广泛的免疫调节和抗肿瘤活性。因此,LZ-8可作为一种抗肿瘤药物,有着巨大的研发潜力。由于野生灵芝提取量低等原因,目前LZ-8的制备大多采用基因工程的方法,即重组灵芝-8(rLZ-8)。rLZ-8作为一种基因工程药物,其制备已经日趋成熟,但到目前为止还没有一套标准,快速的检测方法。因此,本文采取噬菌体展示技术筛选rLZ-8配体短肽的方法,建立对rLZ-8蛋白检测的方法,替代单克隆抗体,实现快速,便捷,实时检测rLZ-8,为抗肿瘤药物的检测提供一种新产品和生物学检测方法。本研究首先利用噬菌体展示技术,经过四轮筛选,得到与rLZ-8特异性结合的重组噬菌体。随机挑选克隆子进行ELISA鉴定并提取其ssDNA,进行测序及序列比对,得到一条与rLZ-8特异性结合较强的多肽L-T-P-H-K-H-H-K-H-L-H-A。合成该多肽,并将该多肽分别进行生物素化和KLH蛋白修饰。生物膜干涉方法验证多肽和rLZ-8的结合能力,KD值为9.5×10-7M。利用偶联KLH的多肽建立检测rLZ-8的方法学,并进行稳定性,重复性,回收率的实验,评价方法学的可行性。实验结果显示,该多肽与rLZ-8蛋白所建立的检测标准曲线为y=0.412x+0.1361。回收率在95%~110%之间,重复性:高低值样本CV%分别为3.53%和6.12%,稳定性:高低值样本CV%分别1.30%,2.10%,均在可接受范围内。该方法应用于rLZ-8发酵液的监测,结果与电泳结果一致。为蛋白质药物开发提供新的检测手段。
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