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大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid,BP)是一种好发于老年人,临床表现为紧张性水疱、大疱的慢性自身免疫性水疱性皮肤病,治疗目前主要依靠应用糖皮质激素和免疫抑制剂等方法。BP病情易反复发作,长期应用激素等治疗产生的副作用是临床实际工作中急需解决的问题[1]。BP组织病理学表现为表皮下水疱形成,疱内可见到以嗜酸性粒细胞为主,包括淋巴细胞及中性粒细胞等多种炎细胞的浸润。患者血清中可以检测到特异性针对皮肤真表皮连接处的基底膜带(BMZ)的自身抗体,直接免疫荧光亦可以发现患者皮肤BMZ有抗体(IgG、IgE等)和补体沉积。目前研究认为BP的发病机制是由患者体内循环自身抗体介导补体激活、肥大细胞及中性粒细胞等炎细胞参与而最终导致皮肤真表皮交界处水疱发生的复杂过程[2]。BP180属于胶原蛋白家族成员,位于皮肤基底膜带半桥粒上的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,又称ⅩⅦ型胶原(COL17)或大疱性类天疱疮抗原2 (BPAg2),在真表皮连接中发挥重要作用。目前认为BP180为BP致病性自身抗体所识别的主要靶抗原,其细胞外区域第16非胶原编码区(NC16A)是致病性自身抗体所识别的主要靶表位区[3]。BP致病性自身抗体与BP180等自身抗原特异性结合并激活补体,造成明显的免疫炎症反应,导致真表皮分离最终发生表皮下水疱。Nishie[4]等在BP180人源化动物模型上证实BP患者血清自身抗体在BP发病中发挥了关键作用,更深层次地揭示了BP的发病机理。在此过程中,自身抗体与BP180等自身抗原结合,进而激活补体是非常重要的环节。因此,我们通过制备人源性基因工程单链抗体,利用其能特异性识别靶抗原而又因不含有补体结合位点的Fc段,不能激活补体的特性,封闭与BP自身抗体结合的自身抗原表位,阻断自身抗体与自身抗原的结合,干预后续的免疫炎症反应,从而消除自身抗体的致病作用,探寻一种新的治疗BP的生物学方法。我们前期构建了针对BP180-NC16A的单链抗体(single chain Fv,scFv),并实现了其可溶性表达及纯化[5, 6]。本研究对所获得的单链抗体进行功能学的鉴定,观察其对BP血清IgG自身抗体的竞争性抑制作用,构建BP体外冰冻切片模型,并在此模型中验证所获得的单链抗体可竞争性抑制由于BP自身抗体结合抗原引起后续免疫炎症反应,从而导致真表皮分离的发病过程。我们的研究为BP特异性的生物治疗提供实验依据,同时也为以自身抗体作为主要致病机制的自身免疫病治疗提供了一个新的研究方向。目的:对人源性抗BP180单链抗体进行生物学功能的鉴定。方法:蛋白亲和层析的方法纯化BP血清自身抗体,通过竞争性ELISA、竞争性免疫荧光和补体活化的竞争性抑制实验来观察所制备的单链抗体对自身抗体的竞争抑制作用。构建BP体外冰冻切片模型,利用此模型观察所制备的单链抗体对自身抗体所致真表皮分离的抑制作用。结果:抗BP180-NC16A scFv对BP血清IgG抗体具有较好的抑制效果。竞争性ELISA各浓度组间A450值下降明显,在0-60μg范围内成剂量依赖关系,最大抑制率可达到69.50%(与对照组相比均有统计学意义,P<0.01);间接免疫荧光实验及补体活化的竞争抑制实验在抑制前可见线性荧光沉积条带,经scFv抑制后则无荧光条带。BP冰冻切片组织模型HE染色可见真表皮的分离,加入不同浓度的单链抗体后真表皮的分离受到明显的抑制。结论:我们所制备的抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体对致病性自身抗体结合抗原具有一定的竞争抑制作用,为工程抗体封闭自身抗体抗原表位这一治疗策略提供了实验依据。