B7-H3是共刺激分子B7家族的重要成员,近年来关于其在肿瘤细胞上的异常表达以及在肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸的研究引起了广泛的关注。B7-H3蛋白在人体正常组织不表达,在肺癌、尿路移形细胞癌、肾癌、神经母细胞瘤以及前列腺癌等多种肿瘤组织中高表达,被认为与肿瘤细胞生物学行为直接相关。研究发现,在乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌等肿瘤细胞株中抑制B7-H3的表达导致肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力的下降,推测B7-H3可以调控肿瘤本身的发生和转移。而在肝癌中,B7-H3的过表达显著增强肿瘤细胞的增殖、侵袭、粘附迁移能力。此外,一株针对B7-H3的单克隆抗体8H9已经用于治疗神经母细胞瘤的临床一期检测中。尽管如此,B7-H3调控肿瘤细胞生物学行为的作用机制尚未明确。脑胶质瘤是中枢脑系统最常见的恶性肿瘤,约占人颅内肿瘤的45%-60%。病人术后生存率低,易复发,放化疗效果差,这些都与脑胶质侵袭性生长的特性密切相关。肿瘤细胞的侵袭受到多种表达在肿瘤细胞表面的受体分子和肿瘤微环境中的细胞因子调控。最近的研究发现,B7-H3在脑胶质瘤组织和细胞株中高表达,且B7-H3的基因沉默减弱了脑胶质瘤细胞株的侵袭性,在动物实验中也发现,B7-H3基因表达的降低会明显减少肿瘤细胞对周边组织的侵袭,从而表明B7-H3可能成为治疗脑胶质瘤的靶向分子。但由于受体未知,其具体的作用机制尚未清晰,所以,探索B7-H3的未知受体或者与之相作用的分子是B7-H3功能研究过程中亟需解决的问题。鉴此,本研究将以脑胶质瘤为研究对象,分析B7-H3在肿瘤组织中的表达与临床意义,观察B7-H3对肿瘤细胞生物学行为的影响,并进一步探索与B7-H3相互作用的分子及其调控机制,为临床诊断和治疗恶性肿瘤提供新的理论基础和实验依据。此外,本研究前期工作通过用表达B7-H3的恶性胸水细胞免疫小鼠获得抗体,从中选取一株表达最高的单克隆抗体,通过免疫共沉淀和质谱测序的方法进行验证,鉴定结果为特异识别B7-H3单克隆抗体。这也为我们进一步研究B7-H3的生物学功能提供了有力的物质基础和技术手段。本论文分为两部分:一、共刺激分子B7-H3在人脑胶质瘤细胞表达的临床意义及其作用机制【目的】:分析B7-H3在脑胶质瘤中组织中的表达及意义,探讨在脑胶质瘤细胞上表达的与B7-H3相互作用的分子及可能机制。【方法】:采用免疫组化检测脑胶质瘤标本的B7-H3和c-met的表达;Real-time PCR方法检测脑胶质瘤标本、细胞株的B7-H3和c-met m RNA的表达;采用si-RNA干扰的方法下调U87的B7-H3的表达;通过侵袭实验检测细胞的侵袭能力;采用CBA试剂盒通过流式的方法检测细胞因子的分泌;采用蛋白印迹实验探索B7-H3影响侵袭的信号通路相关分子的变化;采用基因转染的技术建立过表达B7-H3-HA的U87细胞株;通过免疫共沉淀的方法鉴定与B7-H3相互作用的分子;免疫荧光技术和共聚焦显微镜检测B7-H3和c-met在U87细胞上共表达现象。【结果】:(1)免疫组化和real-time PCR结果显示,脑胶质瘤组织(200例)的B7-H3的表达与肿瘤的病理分级相关,并与病人生存率呈负相关;(2)抑制脑胶质瘤细胞株U87上B7-H3的表达下调了细胞的侵袭能力,并且引起MMP2(基质金属蛋白酶2)表达以及IL-6和IL-8分泌的下降;(3)相关信号分子AKT,STAT3和JAK2的磷酸化水平都呈不同程度的下调;(4)通过免疫共沉淀的方法发现与B7-H3相互作用的分子为c-met(肝细胞生长因子受体),而B7-H3的下调可引起原癌基因c-met磷酸化水平的下降。进而共聚焦和免疫组化检测显示,B7-H3与c-met在脑胶质瘤细胞株和肿瘤组织中呈共表达。临床标本分析也发现B7-H3与c-met的m RNA和蛋白水平在组织标本中呈正相关。【结论】:脑胶质瘤中B7-H3的表达与病理分级以及病人术后生存率相关,抑制B7-H3分子的表达下调了肿瘤细胞的侵袭能力,这有可能是通过抑制了肿瘤细胞中MMP2的表达以及IL-6和IL-8的分泌,并且涉及到AKT/STAT3/JAK2等信号通路。本研究首次证实,B7-H3可与c-met相互作用,并在肿瘤细胞和组织上共表达,提示B7-H3对脑胶质瘤细胞侵袭的作用可能通过与c-met途径介导。这为进一步研究B7-H3的生物学功能和脑胶质瘤新的诊断和治疗方法提供了原创性的理论依据。二、鼠抗人B7-H3单克隆抗体的制备和生物学功能的鉴定【目的】:通过表达B7-H3的恶性胸水免疫细胞免疫BALB/c小鼠获得特异性单克隆抗体,用抗体识别抗原的方法进行免疫共沉淀,并通过质谱测序的方法鉴定对应的抗原,并初步研究其生物学功能。【方法】:用表达B7-H3的恶性胸水免疫细胞作为免疫原免疫BALB/c小鼠,用本试验的骨髓瘤细胞(AG8)和小鼠脾脏细胞融合方法选择性培养,用PBMC作为阴性筛选细胞株,用胸水免疫细胞为阳性筛选细胞株,通过流式细胞术对杂交瘤进行筛选。后通过抗原抗体结合的方法,用免疫功共沉淀和质谱测序的技术方法鉴定抗原分子。纯化单克隆抗体,并对其生物学功能进行初步研究。【结果】:成功获得78株特异性分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以其中一株筛选表达最高的作为我们的研究对象,命名为Y4F11,因其与胸水免疫细胞和U937的结合最高,用银染和质谱测序的方法检测到细胞经过免疫共沉淀实验后结合的抗原分子均为B7-H3。【结论】:成功鉴定Y4F11所对应的抗原分子为B7-H3,为我们进一步研究B7-H3及其生物学功能提供了物质基础。同时建立一种抗体鉴定抗原的方法和实验体系,为我们继续发现更多的细胞表面活化分子和研究它们的生物学功能提供了有价值的技术手段。