禽流行性感冒，简称禽流感（Avian Influenza，AI），也称真性鸡瘟，是由A型流感病毒引发的主要以感染禽类为主的传染病。国际兽医局(OIE)将高致病性禽流感定为A类传染病，中国农业部将其列为甲类监测传染病，并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。　　野生鸟类是禽流感病毒（AIV）的天然宿主，在野生鸟类中可以分离到禽流感病毒的所有16个HA亚型和9个NA亚型。随着候鸟的迁徙，带毒候鸟可能会将禽流感病毒传播到世界各地，因此，通过对野生鸟类进行禽流感的分子流行病学监测，对禽流感早期预警具有重要的指示意义。　　本论文于2003年2月至2010年4月对黑龙江及其他部分地区的野生鸟类进行了禽流感的分子流行病学调查，一方面调查了这些地区野生鸟类中禽流感病毒的分布情况，另一方面选取了有代表性的毒株进行了基因克隆和序列的分子遗传特征分析。　　一、黑龙江地区野生鸟类禽流感的流行学调查　　2003年2月至2010年4月在黑龙江及其他部分地区的湿地、森林、农田和城市采集了1848份样品，其中野鸟样品1823份，包括11个目、32个科、78个属、129种，家鸭样品19份，环境水样5份，狮子样品1份。　　通过SPF鸡胚宿主系统进行禽流感病毒的分离，盲传三代后利用血凝试验进行AIV的初步检测，最后用RT-PCR方法进行病毒的鉴定，结果有53份样品经PCR反应呈AIV阳性，病毒分离率为2.8680％(53/1848);利用血凝抑制试验(HI)和神经氨酸酶抑制试验(NI)并结合RT-PCR方法对53份AIV阳性样品进行病毒亚型的鉴定，结果从53份AIV阳性样品中共鉴定出59株AIV（2009年春季龙凤地区的3份样品为H4/H5/H13/N1/N2的混合感染）。　　病毒分离结果显示，不同生境类型样品的病毒分离率不同，在湿地采集样品的病毒分离率较高;不同宿主类型样品的病毒分离率不同，雁鸭类样品的病毒分离率较高;不同年龄野鸭病毒分离率不同，幼龄鸭病毒分离率较高;不同采样时间病毒分离率不同，秋季病毒分离率较高;不同采样部位病毒分离率不同，棉拭子样品病毒分离率较高。　　58株AIV的亚型鉴定结果显示（1株AIV没鉴定出亚型），HA亚型包括2株H1、4株H2、9株H3、7株H4、8株H5、13株H6、3株H7、8株H11、4株H13，没有分离到H8、H9、H10、H12、H14、H15、H16; NA亚型包括24株N1、15株N2、7株N6、2株N7、8株N8、2株N9，没有分离到N3、N4、N5。因此，2003-2010年黑龙江地区7年的流感监测结果表明，H6和H3为黑龙江地区的优势HA亚型，N1和N2为黑龙江地区的优势NA亚型，它们分别占黑龙江地区病毒分离总数58株（已确定亚型）的22.4138％、15.2542％和41.3793％、25.8621％。　　通过对黑龙江地区野生鸟类进行长达7年的禽流感流行病学调查，首次在中国大陆对野生鸟类进行了长期系统的流感监测，同时我们还建立了一个中国大陆亚型最丰富的野鸟源禽流感病毒的保存库。　　二、代表性分离株的基因克隆及序列分析　　为了了解黑龙江地区野生鸟类中禽流感病毒基因的进化和遗传变异情况以及与家禽流感和人流感的相关性，我们从本研究分离的59株病毒中选取了有代表性的毒株的基因进行克隆和测序，结果共成功获得210条基因序列，其中36条HA、31条NA、25条PB2、23条PB1、24条PA、23条NP、24条M、24条NS。　　各病毒基因的同源性比较和遗传进化分析结果显示，黑龙江地区的野生鸟类是一个复杂的禽流感病毒的基因库，不同亚型的病毒之间以及亚型相同的不同病毒之间的相应基因都有着不同的进化来源，经总结归纳得出如下结论:　　1、克隆得到的36株病毒的血凝素蛋白裂解位点以及其他关键位点的比较分析，可以看出只有2株分离株LK/HB/194/07(H5N1)和L/China/Z-1/08(H5N1)符合高致病性禽流感的典型分了特征，因此黑龙江地区野生鸟类携带的主要以低致病性禽流感为主。　　2、外部基因的同源性比较和遗传进化分析结果显示，黑龙江地区野生鸟类中不同亚型流感病毒的HA和NA之间存在着广泛的基因重排现象。　　3、部分外部基因(H2、H6、N1、N6)在北美大陆和欧亚大陆之间存在禽流感病毒基因的交流，说明候鸟可以携带部分低致病性禽流感做长距离迁徙，日本和阿拉斯加可能就是流感病毒在欧亚和北美大陆之间进行传播和基因交流的首要站点。　　4、内部基因的同源性比较和遗传进化分析结果显示，黑龙江地区野生鸟类中禽流感病毒的内部基因来源复杂多样，并且在北美大陆和欧亚大陆之间禽流感病毒的内部基因存在着广泛的和普遍的基因交流。　　5、尽管不同亚型的病毒之间以及亚型相同的不同病毒之间的相应基因都有着不同的进化来源，但是本研究分离株的大多数基因与日本、韩国毒株的亲缘关系较近，说明在韩国、日本和中国之间流感病毒存在频繁的基因交流和交换。　　6、H4N6、H5N1、H7N1与其他分离株的进化来源不同，H4N6分离株起源于台湾早期毒株，同时还发现H4亚型流感病毒在黑龙江地区的家鸭和野鸭中存在着相互传播现象;H5N1分离株LK/HB/194/07(H5N1)和L/China/Z-1/08(H5N1)不同于广东96、香港97、青海湖等中国以往的代表株，而是起源于越南A/chicken/Vietnam/216/2005(H5N1)的一株新基因型病毒;H7N1分离株BP/HN/414/10(H7N1)起源于欧洲（捷克或斯洛文尼亚），同时发现不同时间、不同地点、不同宿主的H7亚型流感病毒受体结合位点是十分保守的。　　7、分离株CS/SJ/355/07(H11N8)的H11基因单独形成一个聚群，与其它参考毒株的同源性均不是很高，最高为duck/England/56(H11N6)(95％)，并且分离株与猪流感病毒swine/KU/2/01(H11N6)同源性较高(94.9％)，同时，血凝素受体结合位点为133V和222R，与猪源毒株一致，说明分离株CS/SJ/355/07(H11N8)有可能是最新变异产生的一个新毒株，并有可能对猪等哺乳动物具有易感性，从而引发新的流行。　　8、同源性比较及遗传进化分析结果显示，分离株G/SJ/160/06(H5N2)是韩国猪流感swine/Korea/C13/2008(H5N2)的供体毒株。　　9、通过基因的核苷酸和氨基酸多序列比对，发现了在血凝素蛋白裂解位点、受体结合位点以及其他基因中与毒株的宿主范围和地域分布相关的几个关键位点。　　10、首次在中国大陆的野生鸟类中分离到H4N6、H7亚型流感病毒，并成功获得其病毒的全序列。　　11、建立了中国大陆基因型最丰富的野鸟源禽流感病毒的基因库。