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该研究以sTNFRI为钓饵,从噬菌体随机环肽库中筛选可模拟TM-TNF-α生物学活性的短肽,从而为研制类似TM-TNF-α抗瘤效应的新型肽类药物奠定基础.一、筛选模拟TM-TNF-α的噬菌体展示肽1.噬菌体肽库的亲和筛选:以sTNFRI为靶分子,对噬菌体随机环肽库进行亲和筛选.在筛选过程中,通过降低靶分子的浓度、减少靶分子与肽库的作用时间、增加洗脱强度等方法,去除非结合和弱结合的噬菌体肽,经三轮筛选后得到高度富集的、与TNFR具有高亲和力的特异性噬菌体克隆.2.用胞毒效应筛选TM-TNF-α模拟肽:随机挑取37个经三轮筛选后的噬菌体克隆,分别观察它们对sTNF-α敏感细胞株U937和耐受细胞株HL-60的胞毒效应.3.TM-TNF-α模拟肽氨基酸序列分析:从29个模拟TM-TNF-α以噬菌体克隆中选取9个克隆进行噬菌体DNA测序,以此确定氨基酸序列.二、模拟TM-TNF-α噬菌体展示肽体外生物学活性;1.不同噬菌体展示肽致肿瘤细胞死亡方式的比较:该室的前期研究工作证实:TM-TNF-α主要引起靶细胞的凋亡,而sTNF-α则主要引起靶细胞的坏死.将TNF和噬菌体展示肽作用于HepG2细胞3h后,用Annextin-V-FITC和PI对HepG2细胞进行染色.2.不同噬菌体展示肽对SODDmRNA表达水平的影响:RT-PCR结果显示:TM-TNF-α及其模拟噬菌体展示肽使U937细胞和HL-60细胞的SODDmRNA表达水平增加(分别增加55.25﹪,47.67﹪和53.67﹪,48.15﹪),而sTNF-α及其模拟噬菌体展示肽则无此作用.3.不同噬菌体展示肽对HL-60胞浆IκB水平的影响:Western-blotting结果显示sTNF-α及其模拟噬菌体展示肽可使HL-60细胞胞浆IκB水平下降,而TM-TNF-α及其模拟噬菌体展示肽则无此作用.提示:sTNF-α模拟肽同sTNF-α一样可明显增强IκB的降解,从而促进NF-κB的核转位.三、模拟TM-TNF-α噬菌体展示肽体内杀瘤效应的比较;给肝癌负荷动物注射不同剂量、不同模拟TM-TNF-α噬菌体展示肽,结果显示:两个模拟TM-TNF-α作用的噬菌体展示肽在体内均有显著的杀瘤能力,其中31号噬菌体展示肽的抑瘤作用最强,抑瘤率达76.7﹪,且其作用呈明显的剂量依赖性. 综上所述,用噬菌体展示技术,我们筛选到TM-TNF-α模拟环肽,可模拟TM-TNF-α在体外杀伤sTNF-α耐受肿瘤细胞,引起肿瘤细胞凋亡,对IκB无影响;在体内可有效抑制肿瘤生长.从而为进一步研制模拟TM-TNF-α的新型肽类药物提供重要的线索.