脓毒症是感染、创伤的严重并发症,病情可迅速进展为感染性休克及多器官功能障碍,严重危及患者生命,其病死率高达40～60%。脓毒症的病理生理过程十分复杂,近年研究发现血管内皮损伤与脓毒症的发展密切相关,是影响脓毒症预后的首要环节。在创伤或感染的全身炎症阶段,血管内皮损伤,其损伤导致血管内皮通透性增加,大量液体渗入组织间隙,加重组织细胞缺氧,诱导促炎介质聚集,释放大量氧自由基和蛋白酶,并进一步诱发微循环功能障碍。骨髓来源的内皮祖细胞将被动员进入外周血,特异性分化为血管内皮细胞,修复受损血管,这种修复是机体对损伤的血管内皮细胞唯一的修复方式。但内皮祖细胞动员与激活的信号通路和作用机制尚不明确。近来研究报道脓毒症中长链非编码RNA表达水平的变化可参与调控内皮细胞的血管生成,能提示脓毒症预后,且长链非编码RNA-NEAT2在缺氧环境下可调控血管内皮细胞增殖和迁徙功能。综上,我们推测在脓毒症中,长链非编码RNA-NEAT2可能通过调控内皮祖细胞数量和功能,影响血管内皮细胞,进而影响脓毒症预后。本研究拟构建小鼠脓毒症模型,观察内皮祖细胞数量和功能在脓毒症进展过程中的变化,检测长链非编码RNA-NEAT2表达水平在脓毒症中的变化,并分析其与内皮祖细胞数量和功能变化的相关性,为临床治疗脓毒症探索新的靶点提供理论依据及实验基础。第一部分脓毒症进程中小鼠内皮祖细胞数量及功能的变化目的:建立稳定的小鼠脓毒症模型,分离、培养小鼠骨髓源性内皮祖细胞,检测脓毒症进展过程中循环内皮祖细胞数量变化,骨髓来源内皮祖细胞功能变化。方法:将36只SPF级Balb/C小鼠(雄性,6-8周龄,体重27±2g)随机分为2组:实验组18只实施盲肠结扎穿刺,对照组18只实施假手术。观察2组小鼠在固定时间点的精神状态及生活习性变化,血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、血管内皮生长因子变化以及肝肾功能变化。处死小鼠后,获得骨髓冲洗液,通过差速贴壁法分离培养出内皮祖细胞,并通过免疫荧光染色、流式细胞鉴定、双吞噬实验对其进行鉴定。同样在固定时间点,经尾静脉取外周血,流式细胞检测外周血中内皮祖细胞数量;其次分离培养骨髓来源内皮祖细胞,检测各个时间点内皮祖细胞的血管生成功能、迁徙功能,及其与脓毒症小鼠预后的关系。结果:实验组小鼠在盲肠结扎穿刺后精神状态萎靡,血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、血管内皮生长因子、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐均发生明显变化,显著高于对照组。通过差速贴壁法分离培养骨髓单核细胞,免疫荧光染色结果CD31(+),CD34(+++),流式细胞鉴定CD31阳性率23.78±4.12%,CD34阳性率90.09±3.89%,CD133阳性率85.52±2.28%,CD309阳性率74.92±3.32%,双吞噬实验双阳性细胞占80%以上,鉴定为内皮祖细胞。建模成功后,实验组外周血内皮祖细胞数量明显增加,内皮祖细胞血管生成和迁徙功能较对照组均明显增强。结论:盲肠结扎穿刺法成功构建了稳定小鼠脓毒症模型,分离培养出内皮祖细胞。在脓毒症早期,内皮祖细胞数量上调,血管生成功能、迁徙功能增强。第二部分脓毒症进程中内皮祖细胞与lnc RNA-NEAT2表达变化的相关性研究目的:探讨脓毒症中长链非编码RNA-NEAT2表达水平与内皮祖细胞数量及功能的相关性。方法:同第一部分方法建立小鼠脓毒症模型,在脓毒症过程中各个时间点,分离培养骨髓来源内皮祖细胞,检测各个时间点内皮祖细胞中长链非编码RNA-NEAT2表达水平。通过sg RNA下调长链非编码RNA-NEAT2表达,观察内皮祖细胞的功能变化。结果:实验组中,小鼠内皮祖细胞中长链非编码RNA-NEAT2的表达丰度随脓毒症病程加重逐渐升高,最高时丰度为2.229±0.175,为正常水平2倍;而对照组中,在假手术后小鼠内皮祖细胞细胞中长链非编码RNA-NEAT2的表达丰度与假手术前相当,未见明显升高,两组小鼠长链非编码RNA-NEAT2表达丰度差异具有统计学意义(p<0.05)。经过相关性分析,lnc RNA-NEAT2表达量与外周血EPCs数量,EPCs血管生成功能、迁徙功能均呈强正相关性,Pearson系数分别为0.935、0.842、0.849(所有p<0.05)。下调长链非编码RNA-NEAT2表达后,其表达相对丰度为0.433±0.088,内皮祖细胞新生血管数量6.67±2.52个/HP、迁徙细胞数0.53±0.15×10~4个,均较空白组下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:在脓毒症小鼠模型中,长链非编码RNA-NEAT2表达上调,与内皮祖细胞数量及血管形成功能、迁徙功能具有强相关性。下调长链非编码RNA-NEAT2表达后,内皮祖细胞功能下降。