鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）属于α疱疹病毒亚科成员,在α疱疹病毒亚科中,UL6蛋白一般在细胞核内发挥功能,但是目前对于DPV UL6蛋白如何进入细胞核这一问题尚未阐明。本文通过构建重组病毒以及间接免疫荧光等实验方法发现UL6蛋白定位于细胞核内,并进一步阐明DPV UL6蛋白的入核机制,以及对构建的病毒突变株进行疫苗潜力评价。围绕上述目的,进行的主要研究内容以及获得的结果如下:1.DPV UL6蛋白核定位信号（NLS）的鉴定重组病毒DPV-UL6-Flag在感染鸭胚成纤维细胞（DEF）24 h,UL6蛋白主要定位于细胞核;真核表达质粒p CAGGS-UL6瞬时转染DEF及DF-1细胞,UL6蛋白均主要定位于细胞核。生物信息分析表明126～157和732～746位氨基酸分别是UL6蛋白的双分型核定位信号（bNLS）和单分型核定位信号（mNLS）;针对两段NLS构建相应UL6蛋白突变体,通过间接免疫光发现UL6126-790、UL6158-790、UL6△126-157、UL61-731和UL6△732-746突变体均定位于细胞质。这个结果说明bNLS以及mNLS对UL6蛋白的入核产生重要影响,且UL6的N端有对UL6蛋白入核产生重要影响的序列。经对UL6 N端序列进行检测后发现UL6111-790以及UL6△59-110突变体主要定位于细胞质中,说明59～110位氨基酸对鸭瘟病毒UL6蛋白的入核有重要影响。2.DPV UL6蛋白NLS的功能检测将UL6蛋白59～110位氨基酸、bNLS以及mNLS分别与外源蛋白EGFP以及EGFP-β-Gal融合表达,检测三者是否分别具有核定位信号能力。通过间接免疫荧光发现,59～110位氨基酸、bNLS均不具有携带外源蛋白入核的能力,仅在融合表达mNLS时EGFP蛋白有明显的核内聚集现象,而当mNLS与EGFP-β-Gal融合表达时呈现核和质均有的状态,说明mNLS具有较弱的核定位信号功能。为进一步验证59～110位氨基酸、bNLS以及mNLS的核定位信号的功能,对三者进行协同作用检测结果表明,在融合表达bNLS与mNLS的情况下,EGFP蛋白大部分定位于细胞核内,并出现完全定位于细胞核的现象;EGFP-β-Gal蛋白呈现核和质均有分布,说明bNLS与mNLS之间具有协同作用,而59～110位氨基酸不具有核定位信号的能力。3.DPV UL6蛋白NLS关键氨基酸的鉴定分别将UL6蛋白mNLS以及bNLS中的131R、142R、152K、737K、738R、740R突变为丙氨酸（A）,结果发现,131R和152K未对UL6蛋白入核产生影响,142R和737R对UL6蛋白入核有一定影响,而738R以及740R对UL6蛋白入核产生重要影响。4.DPV-UL6R142A突变株疫苗的潜力初评通过Red重组的方法构建感染性克隆DPV-UL6R142A,并获得DPV-UL6R142A突变株。将DPV-UL6R142A与DPV-BAC接种于10日龄鸭胚尿囊腔中,从致死性、剖检变化以及病毒在鸭胚中拷贝数的变化三方面进行观察。在检测鸭胚的存活率实验中,DPV-UL6R142A组的鸭胚死亡稍晚于DPV-BAC组。DPV-UL6R142A对鸭胚的致病能力与亲本株的DPV-BAC相似。在检测病毒在鸭胚中的复制情况时发现,DPV-UL6R142A突变株的增殖时间晚于亲本株DPV-BAC,但二者最终达到相似的复制平台期,说明DPV-UL6R142A突变株对鸭胚的致病性以及复制能力均与亲本株相似。与此同时,DPV-UL6R142A突变株在雏鸭体内不能进行复制,因此DPV-UL6R142A突变株不具备作为疫苗候选株的潜力。综上所述:鸭瘟病毒UL6蛋白在感染病毒与瞬时表达时均主要定位于细胞核内。UL6蛋白的第59～110位氨基酸、bNLS以及mNLS对门蛋白的入核都有影响,但只有mNLS具有较弱的核定位能力。UL6蛋白bNLS与mNLS之间存在协同作用,可以共同促进蛋白的入核。其中mNLS中的第738R、740R是UL6蛋白进入细胞核的关键氨基酸。DPV-UL6R142A突变株虽然对鸭胚的致死率及在鸭胚中的复制能力均滞后于DPV-BAC,但最终达到了与野生株相似的致死性及复制能力,且无法在雏鸭体内复制,说明DPV-UL6R142A突变株不具有成为疫苗候选株的潜力。