牙周膜干细胞(PDLSCs)是牙周组织再生的理想种子细胞,但是在慢性炎症微环境作用下,PDLSCs的再生能力下降,从而导致不可逆的牙周组织破坏、牙槽骨吸收及牙齿松动等症状。慢性炎症的发生是机体对感染和/或其他诱因的反应,可以产生大量的炎症因子,直接或间接导致组织损伤,并干扰组织再生修复过程,这是一个复杂的生物学过程。炎症因子尤其是TNFα可以激活一系列下游级联反应,造成炎症状态加剧及组织破坏,可以导致慢性炎症性疾病,如关节炎、牙周炎等。在菌斑、牙石等的始动因素作用下,牙周组织因局部免疫反应过度形成慢性炎症及损伤,进而出现牙槽骨渐进性吸收,牙齿松动等症状。在牙周炎慢性微环境作用下,PDLSCs成骨分化能力降低,修复再生能力减弱。这是牙周炎中,牙槽骨不可行逆性吸收的根本原因。在此过程中,免疫细胞也发挥重要的作用。T细胞在牙周炎的进展阶段的炎性浸润组织中高表达。CD3分子在所有的T细胞表面均有表达,CD3+T细胞是适应性免疫系统的主要效应细胞,其具有抗原特异性,是同源免疫记忆的核心。我们已知在慢性牙周炎中,牙周组织的先天免疫及适应性免疫失调。在慢性微环境的影响下PDLSCs的免疫调节能力也会降低。经典Wnt通路在胚胎发育、机体稳态的维持等方面都发挥重要的作用。经典Wnt/β-catenin通路在成骨分化过程中,成骨、破骨平衡中都发挥重要的作用。TNFα可以激活β-catenin,使其在慢性炎症的骨吸收及骨稳态平衡中发挥作用。在牙周炎的牙槽骨吸收及改建过程中,经典Wnt/β-catenin发挥重要的作用。同时Wnt通路还可以影响先天性和适应性免疫。目前,间充质干细胞(MSCs)可以抑制活化的淋巴细胞增殖,在许多炎性相关和自身免疫相关疾病中都被广泛研究。但是牙周炎微环境下,PDLSCs的免疫调节能力降低的机制,Wnt通路在免疫及成骨分化分化过程中发挥作用的机制,及CD3+T细胞在此过程中发挥作用的机制尚未被完全阐明。本课题的研究目的和方向为,研究PDLSCs与CD3+T细胞相互作用的机制,探究炎症微环境下PDLSCs发挥免疫调节作用的关键分子对于PDLSCs的临床应用有着重要的意义。本课题分为以下四部分。第一部分:炎症微环境对PDLSCs生物学功能的影响方法:1、收集因正畸拔除前磨牙及智齿,刮取根中1/3部分牙周膜,有限稀释法分离培养HPDLSCs,用1Ong/mL TNFα构建的炎症微环境,获得炎症PDLSCs(IPDLSCs),并进行细胞克隆形成.多向分化能力、细胞周期及细胞凋亡检测等。2、提取PDLSCs组及IPDLSCs组mRNA并反转录为cDNA后,qPCR检测Runx2、ALP、TNFα等的基因表达。结果:1、HPDLSCs及IPDLSCs呈长梭形,包浆饱满。2、IPDLSCs克隆形成单个集落细胞多于PDLSCs,且克隆形成的时间较早。但是成脂、成骨能力较PDLSCs显著降低,增殖能力增强。第二部分:炎症微环境对PDLSCs免疫调节能力的影响方法:1、新鲜人外周血与无菌PBS1:1稀释后,缓慢加入人外周血单个核淋巴细胞分离液,利用密度梯度离心法获取人外周血白膜层,即人外周血单个核细胞。CD3+磁珠孵育人外周血单个核细胞,上磁力分选架分离获取CD3+T细胞。2、人HPDLSCs、IPDLSCs 与 CD3+T 细胞分别以以下比例:1:10,1:20,1:50,1:100共培养,共培养48h,提取各组PDLSCs的RNA,反转录为cDNA后,qPCR检测 Runx2、TNFα、β-catenin、LEF1、TCF4 等的基因表达。3、提取CD3+T细胞的RNA,反转录为cDNA后,qPCR检测周期蛋白CCND1 mRNA表达水平。结果:1、密度梯度离心法可以获取人外周血的清晰分层,由上至下分别为稀释血浆、单个核细胞、粒细胞、红细胞。通过免疫磁珠分选法利用CD3e磁珠分离获取CD3+T细胞,呈圆形,悬浮生长。2、共培养比例为1:20和1:50时,HPDLSCs组Wnt通路关键基因β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均降低。1:20时,有趣的是TCF4 mRNA的表达水平增加,但是1:50时降低。1:20时,IPDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均增加,而在1:50时基因的表达水平均降低。1:20及1:50时TCF4的表达水平均降低。3、PDLSCs及IPDLSCs对CD3+T细胞增殖具有明显抑制作用,在1:20及1:50时抑制作用最为显著。4、在共培养比例1:20时,与HPDLSCs及与IPDLSCs共培养的CD3+T细胞CCND1 mRNA表达水平均降低,但后者的表达水平仍高于前者。第三部分:CD3+I细胞对HPDLSCs、IPDLSCs成骨分化能力的影响方法:1、HPDLSCs及IPDLSCs与CD3+T细胞分别以1:20比例进行共培养48h后,分别进行成骨诱导7d。2、检测HPDLSCs及IPDLSCs炎症因子TNFα mRNA表达、成骨基因Runx2 mRNA表达、经典Wnt通路基因β-catenin mRNA表达等。结果:1、共培养组HPDLSCs及IPDLSCs Runx2 mRNA表达水平增加,但较对照组成骨诱导条件下PDLSCs mRNA的表达水平降低。2、在1:20的共培养比例下,HPDLSCs组在共培养后β-catenin mRNA的表达水平显著降低。IPDLSCs组β-catenin mRNA的表达水平增加。第四部分:Wnt通路的调控机制方法:1、PDLSCs及IPDLSCs与CD3+T细胞1:20的比例进行共培养,48h后分别检测PDLSCs及IPDLSCs炎症因子TNFα mRNA表达、成骨基因Runx2、ALP mRNA表达、增殖相关基因β-catenin mRNA表达等。2、检测HPDLSCs及IPDLSCs Wnt5a蛋白的表达。结果:1、空转染IPDLSCs组在与CD3+T细胞共培养后,TNF α mRNA的表达水平降低。过表达HPDLSCs组及IPDLSCs组TNF α mRNA的表达水平均增加,后者增加明显。而与CD3+T细胞共培养后,IPDLSCs组TNFα mRNA的表达水平明显降低。2、空转染HPDLSCs在与CD3+T细胞共培养后,TCF4 mRNA的表达水平提升,约提高1.1倍,而空转染IPDLSCs与CD3+T细胞共培养后,TCF4 mRNA的表达水平降低了 2.5倍。β-catenin过表达组HPDLSCs及IPDLSCs组TCF4 mRNA的表达水平均增加,分别增加2.4倍、2.6倍。而与CD3+T细胞共培养后,β-catenin过表达IPDLSCs TCF4 mRNA的表达水平明显降低。而HPDLSCs组明显提高。3、空转染IPDLSCs组在与CD3+T细胞共培养后,TNFα mRNA的表达水平降低。SiRNA β-catenin HPDLSCs 组及 IPDLSCs 组 TNF α mRNA 的表达水平均增加。而与CD3+T细胞共培养后,HPDLSCs组IPDLSCs组TNF α mRNA的表达水平均降低,后者降低明显。4、IPDLSCs较PDLSCs Wnt5a的mRNA及蛋白表达水平均增加。结论:1、本实验成功从人健康牙周膜组织中获取了 HPDLSCs,并构建了体外炎症微环境,获取了 IPDLSCs。发现炎症微环境下PDLSCs的成骨能力降低,增殖能力增强。2、本实验成功通过免疫磁珠法从人外周血白膜层获取了 CD3+T细胞,并进行了HPDLSCs、IPDLSCs 与 CD3+T 细胞的不同比例(1:10、1:20、1:50、1:100)共培养,发现在炎症微环境作用下PDLSCs的免疫调节能力降低。3、经典Wnt通路在干细胞的成骨、增殖、免疫调节方面可能都发挥重要的作用。4、Wnt5a在牙周炎的发生发展中可能发挥重要的作用。抑制Wnt5a的表达可能可以降低牙周炎的发生及严重程度。Wnt5a与β-catenin可能相互作用调控成骨过程及骨稳态。