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近年来随着基因组测序技术的发展,研究者们发现稀有放线菌中含有丰富的次级代谢途径,揭示了其编码新天然产物的巨大潜能,但是目前对稀有放线菌的基因组挖掘研究仍相对较少。因此,本课题拟开展稀有放线菌新天然产物的定向发掘研究,以期发现具有潜在开发价值的药物先导,为我国具有自主知识产权的新药创制奠定基础。前期,本课题组利用负责安莎霉素前体3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成的AHBA合酶基因,从实验室已有菌株中筛选获得多株AHBA合酶基因阳性的稀有放线菌。通过对其中部分菌株的基因组扫描和生物信息学分析,我们发现Micromonospora sp.HK160111和Verrucosispo a sp.NS0172 基因组中分别含有编码新型五酮安莎霉素的mas和vas生物合成基因簇;以Micromonospora sp.FXYA29和Micromonospora sp.FXY120为代表的14株小单孢菌基因组中均含有非核糖体肽-聚酮(NRPS-PKS)杂合的非典型安莎霉素生物合成基因簇。为了开展上述新颖基因簇的发掘工作,我们建立了上述AHBA合酶阳性菌株的遗传操作体系,并评价了不同启动子在这些菌株中的启动效率。首先,我们开展了 2类新型五酮安莎霉素的挖掘工作。在Micromonospora sp.HK160111中,我们通过组成型表达mas基因簇中的正调控基因mas13成功激活了该基因簇,并通过对突变株的大规模发酵和激活产物的分离鉴定,成功获得了 9个新颖的五酮安莎霉素microansamycinA-I。与此同时,我们利用相同策略在Verrucosispora sp.NS0172中分别组成型表达了 vas基因簇中的调控基因vas10和vas12,并从vas12组成型表达突变株中获得了五酮安莎霉素前体。对于NRPS-PKS杂合的非典型安莎霉素类生物合成基因簇,我们通过对关键合成基因的敲除实验揭示目标基因簇可能处于沉默状态。随后,我们通过在Micromonosporasp.FXYA29 和 Micromonospora sp.FXY120 中分别组成型表达目标基因簇中的2个LAL家族调控基因,部分激活了目标基因簇。为了获得完整的目标基因簇编码产物,我们在14株小单孢菌中尝试报告基因指示和培养基筛选相结合的激活策略。通过将目标基因簇中第一个PKS基因上游的启动子序列克隆至黑色素报告基因上游,位点特异性整合至原始菌株得到目标基因簇启动子活性指示菌株,经22种培养基筛选以期发现目标基因簇表达培养基。目前,我们已筛选出Micromonospora sp.FXY120中的目标基因簇在HI培养基中可能存在表达,对其代谢产物进行HPLC检测发现疑似表达产物,有待后续进一步验证。此外,我们通过对Micromonospora sp.FXY120基因组的生物信息学分析发现其含有多条新颖次级代谢途径,因此开展了系统的基因组挖掘工作。通过正调控基因组成型表达和结构基因启动子置换策略,获得了 4株(分别对应4个未知基因簇)代谢谱与野生型相比具有明显差异的突变株,目前正在进行激活产物的分离鉴定。本课题以稀有放线菌作为研究对象,以发掘新活性天然产物为研究目标,通过传统天然产物研究手段与新兴基因组挖掘策略相结合,显著提高了新颖活性天然产物的发现几率,并为后续结构改造和产量优化奠定了基础。通过系统有效的挖掘工作,拓宽了稀有放线菌中新天然产物的发现模式,为其它来源天然产物的定向发掘提供了借鉴。