研究目的:胃癌是消化道最常见的具有高度侵袭性的恶性肿瘤,是导致癌症相关死亡的主要原因。随着诊治技术的发展,全球范围内胃癌的发病率和死亡率略有下降,但是全世界每年新诊断胃癌病例仍然超过100万。值得关注的是,大约40%的胃癌新诊断病例和死亡病例发生在中国。由于胃癌早期缺乏特异的临床表现,诊断时多数处于进展期,进展期胃癌生长迅速,恶性程度高,预后差,5年生存率大约只有20%。侵袭转移是导致患者死亡的罪魁祸首。因此,寻找和筛选与胃癌转移相关的关键分子及阐明其作用机制,对确立新的诊断和治疗生物学靶标及改善胃癌预后意义重大。通过胃癌组织mRNA表达谱芯片进行筛选,我们发现TIPRL在转移性胃癌组织中较非转移性胃癌组织低表达。TIPRL首先在酵母中被识别发现,其作为酵母TIP41蛋白的同源物,目前TIPRL在肿瘤中的研究较少,有研究发现TIPRL在肝细胞癌中高表达,并且通过MKK7-JNK信号通路抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。在非小细胞肺癌中,TIPRL可以诱导自噬并可促进肺癌细胞增殖。然而目前TIPRL在胃癌中的研究尚属空白,所以TIPRL在胃癌中的表达情况及其是否与胃癌侵袭转移相关等问题都需要进一步探讨。本研究首先通过实时定量PCR检测非转移性和转移性胃癌组织中TIPRL的mRNA的差异表达;随后免疫组化检测TIPRL在胃癌组织中的表达水平的高低,结合临床病理及随访资料,进一步分析TIPRL在胃癌中的表达及临床意义;通过上调或下调TIPRL的表达及裸鼠动物实验,观察TIPRL对胃癌恶性生物学行为的影响,明确TIPRL抑制胃癌转移的作用;采用荧光素酶实验、表达谱芯片技术高通量筛选等方法探讨TIPRL可能的上下游调控分子及机制。研究方法:1.TIPRL的筛选与验证及胃癌中TIPRL的表达及临床意义（1）采用高通量表达谱芯片筛选技术,检测5例转移性（发生淋巴结转移）胃癌组织与5例非转移性（未发生淋巴结转移）胃癌组织中mRNA表达谱,筛选出可能与胃癌转移相关的基因（筛选标准:差异倍数＞2,P＜0.05,原始信号值＞500）。（2）实时定量PCR检测40例新鲜胃癌组织样本中TIPRL基因mRNA表达水平。利用Kaplan-Meier plotter网络数据库分析了 TIPRL mRNA表达情况与胃癌患者预后的关系。（3）通过免疫组化染色及评分,检测分析TIPRL在104例胃癌组织及86例相应正常胃粘膜中的表达情况。（4）根据染色评分结果,结合随访资料,通过卡方检验分析TIPRL与临床指标的相关性。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,通过log-rank检验评价TIPRL表达与病人预后的关系。2.TIPRL上游调控机制的初步探索首先通过TargetScan和microRNA.org软件预测可能与TIPRL基因3’UTR区域结合的miRNA,其次构建野生型和突变型TIPRL-3’UTR报告基因载体,最后利用荧光素酶实验和Western blot进一步验证上游miRNA对TIPRL的调控作用。3.TIPRL对细胞生物学行为的影响（1）构建TIPRL过表达载体及合成TIPRL的干扰RNA,胃癌细胞MKN45和BGC823分别转染pcDNA3.1（+）-TIPRL（过表达质粒）、si-TIPRL（小干扰RNA）和相应的Negative control（阴性对照）后,Western blot检测转染效率。（2）为研究TIPRL在胃癌迁移、侵袭中的作用,在MKN45和BGC823中分别转染pcDNA3.1（+）-TIPRL或si-TIPRL。通过体外Transwell迁移、浸润实验观察TIPRL的表达变化对MKN45和BGC823细胞迁移和侵袭能力的影响。（3）为研究TIPRL在胃癌增殖和凋亡中的作用,在MKN45和BGC823中分别转染pcDNA3.1（+）-TIPRL或si-TIPRL。利用MTS,EdU实验和流式细胞术分别观察改变TIPRL的表达对MKN45和BGC823细胞增殖和凋亡能力的影响。4.TIPRL下游调控分子机制研究（1）通过表达谱基因芯片技术检测过表达TIPRL前后,胃癌细胞MKN45的基因表达变化,从转录（mRNA）水平筛选TIPRL可能调控的下游靶基因,通过实时定量PCR验证芯片结果。（2）通过文献报道分析预测TIPRL从转录后（磷酸化）水平可能调控的下游靶基因,Western blot检测在MKN45和BGC823中过表达或干扰TIPRL对调控细胞迁移侵袭的关键蛋白p-AMPK,p-mTOR,p-p70S6K和p-4E-BP1表达水平的影响。5.体内动物实验利用体外TIPRL过表达慢病毒载体（LV-TIPRL）构建TIPRL过表达细胞株（MKN-45-TIPRL）,首先将稳定过表达TIPRL的细胞株（MKN-45-TIPRL）经尾静脉注射到裸鼠体内,探究TIPRL对胃癌远处转移的影响;其次经裸鼠皮下荷瘤方法探究TIPRL过表达对胃癌生长、局部浸润的影响;通过Western blot在移植瘤组织中验证TIPRL参与调控的信号通路。研究结果:1.TIPRL是胃癌转移相关基因（1）经mRNA高通量芯片筛选,在转移性胃癌组织与非转移性胃癌组织之间检测出372个显著差异表达的基因,其中包括112个表达上调的基因,260个表达下调的基因（GEO数据库:GSE72307）。通过检索文献数据库及结合预后统计分析的结果,最终选择在转移性胃癌组织中表达显著下调的TIPRL作为研究对象进行后续的功能机制研究。（2）采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测TIPRL在13例新鲜非转移性胃癌组织与27例转移性胃癌组织中的表达水平,结果显示:与非转移性胃癌组织相比,TIPRL mRNA在转移性胃癌组织中表达显著下调,与芯片检测结果一致。Kaplan-Meier plotter网络数据库数据显示,TIPRL mRNA低表达与胃癌患者预后不良密切相关。（3）免疫组化染色结果显示:TIPRL主要定位于胞浆。胃癌组织中TIPRL表达要显著低于正常组织（P＜0.001）,且较晚期（Ⅲ+Ⅳ）患者组胃癌组织TIPRL表达低于较早期（Ⅰ+Ⅱ）患者组胃癌组织（P＜0.05）。更重要的是,与未发生远处转移患者组（M0）的胃癌组织相比,发生远处转移患者组（M1）的胃癌组织TIPRL表达显著下调（P＜0.05）。ROC曲线分析显示TIPRL表达可较好地区分正常组织与胃癌组织,其曲线下面积（AUC）为0.6490（P=0.0004）。（4）根据免疫组化评分结果显示,TIPRL的低表达水平与胃癌的肿瘤（TNM）分期（P=0.0467）、远处转移（P=0.0083）和不良预后（P=0.0297）密切相关,而与年龄（P=0.1139）、性别（P=0.8171）、肿瘤大小（P=0.5535）、浸润深度（P=0.1778）、淋巴结转移（P=0.6699）和肿瘤分化（P=0.1542）无相关性,即TNM分期越高和发生远处转移的胃癌患者,TIPRL的表达水平越低。Kaplan-Meier生存分析提示,与高表达TIPRL的胃癌患者相比,低表达TIPRL的胃癌患者总生存时间（P=0.0193）和无瘤生存时间（P=0.0364）明显缩短。2.TIPRL 是 miR-216a-5p 和 miR-383-5p 的靶基因,并且受到 miR-216a-5p和miR-383-5p的负向调控通过软件预测可能与TIPRL基因3’UTR区域结合的miRNA,结合检索NCBI文献数据库及miRNA功能分析,我们挑选出miR-216a-5p,miR-383-5p,miR-29a-3p,miR-29b-3p 以及 miR-29c-3p 等 13 个 miRNAs。荧光素酶实验显示miR-216a-5p和miR-383-5p可以与野生型TIPRL-3’UTR结合并且降低荧光素酶的活性,但是对突变型TIPRL-3’UTR的荧光素酶活性没有任何影响,因此TIPRL是 miR-216a-5p 和 miR-383-5p 的直接靶基因;Western blot 证实 TIPRL 受到miR-216a-5p 和 miR-383-5p 的负向调控。3.TIPRL对细胞生物学行为的影响（1）western blot结果显示:与对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-TIPRL可显著上调MKN-45和BGC-823中TIPRL的表达,而转染si-TIPRL则显著下调MKN-45 和 BGC-823 中 TIPRL 的表达。（2）体外Transwell迁移、浸润实验显示:过表达TIPRL明显抑制MKN-45和BGC-823的迁移和侵袭,敲低TIPRL可促进MKN-45和BGC-823的迁移和侵袭;MTS及EDU结果显示:过表达或敲低TIPRL后,MKN-45和BGC-823的增殖能力无明显变化;流式细胞术结果显示:过表达或敲低TIPRL对细胞凋亡无明显影响。4.TIPRL抑制胃癌侵袭转移的机制研究（1）通过表达谱基因芯片技术来探究TIPRL抑制胃癌侵袭和转移的下游调控分子机制。在MKN-45细胞中分别转染pcDNA3.1（+）-TIPRL或Negative control后进行差异表达基因分析。基因芯片分析结果显示,相比于对照组,在MKN-45中过表达TIPRL后,几乎所有基因的表达未发生显著改变。由此推测,TIPRL可能不在转录（mRNA）水平调控下游靶基因,而是在转录后（磷酸化）水平调控下游靶基因。随后通过RT-qPCR验证了基因芯片分析结果。（2）通过检索文献数据库及TIPRL功能分析,TIPRL在抑制PP2A磷酸酶活性的过程中起着至关重要的调节作用,而PP2A可以通过去磷酸化使AMPK失活。根据TIPRL与PP2A的相互作用,我们推测TIPRL可能通过抑制PP2A,激活AMPK信号通路,从而发挥抑制细胞迁移和侵袭的作用。首先检测TIPRL在MKN45和BGC823细胞中对PP2A活性的影响,过表达TIPRL显著降低PP2A的活性,而干扰TIPRL显著提高PP2A的活性。Western blot结果进一步证实了以上假设,在MKN-45和BGC-823细胞中,过表达TIPRL可增强AMPK的磷酸化水平,降低mTOR,p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平;反之,干扰TIPRL可降低AMPK的磷酸化水平,增强mTOR,p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平,提示AMPK/mTOR信号通路参与了 TIPRL对胃癌细胞侵袭转移的调控。5.动物实验验证TIPRL在胃癌侵袭转移中的作用及机制（1）在肺远处转移模型中,将TIPRL稳定过表达的细胞株（MKN-45-TIPRL）经尾静脉注射到裸鼠体内,结合活体成像技术发现过表达TIPRL组裸鼠的肺转移能力受到明显抑制。（2）在裸鼠皮下荷瘤模型中,将TIPRL稳定过表达的细胞株（MKN-45-TIPRL）注射到裸鼠皮下,发现过表达TIPRL对肿瘤生长无显著影响,但过表达TIPRL可以抑制肿瘤局部浸润。（3）为了进一步研究TIPRL体内抑制胃癌侵袭转移机制,通过Western blot在移植瘤组织中发现,过表达TIPRL可增强AMPK磷酸化水平,降低mTOR,p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平,这与体外细胞实验结果一致。研究结论及意义:1.与正常胃粘膜组织相比,TIPRL在胃癌组织中表达减弱,并且TNM分期越高和发生远处转移的胃癌患者的胃癌组织,TIPRL的表达水平越低;低表达TIPRL与远处转移和肿瘤（TNM）分期密切相关,而且TIPRL表达与患者生存期正相关。2.TIPRL 是 miR-216a-5p 和 miR-383-5p 的直接靶基因,受到 miR-216a-5p和miR-383-5p的负向调控。3.TIPRL抑制胃癌细胞侵袭转移,但TIPRL不影响细胞的增殖和凋亡。4.TIPRL通过抑制PP2A磷酸酶活性,增强胃癌细胞中AMPK的磷酸化水平并且激活AMPK,从而进一步降低下游mTOR,p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平,进而抑制mTOR通路和胃癌侵袭转移。