论文部分内容阅读
目的:本实验主要为了研究中枢nesfatin-1和肥胖SD大鼠在减重术后对摄食行为方面及其相应信号通路的影响。因此首先要明确减重术后,肥胖SD大鼠下丘脑nesfatin-1水平的变化情况。为了进一步研究下丘脑nesfatin-1的作用机制,检测与其相关的信号通路变化情况。研究方法:首先在无特定病原体动物实验室饲养SD大鼠,大鼠在180-200g统一45%高脂饮食喂养,饲养5周后,与普通饮食大鼠相比,体重大于普通饮食大鼠体重10%视为肥胖大鼠。成功构建肥胖大鼠后,将其分为5组:组1,非手术高脂饮食(HFD)组;组2,假手术高脂饮食(sham-HFD)组;组3,假手术限制饮食(HFRD)组;组4,胃袖状切除(SG)组;组5,胃旁路(RYGB)组。手术后,饲养4周后取材,记录体重及摄食量。取血,脑脊液,下丘脑等标本,血、脑脊液离心后-80℃冰箱冻存备用。通过elisa方法测血、脑脊液中nesfatin-1的含量,通过RT-PCR,western blot方法测量下丘脑内nesfatin-1表达情况。之后再进一步测量nesfatin-1相关信号通路黑皮质素3/4受体(MC3/4R),细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白表达变化。再次构建肥胖大鼠模型,方法同上,饲养5周后,将肥胖大鼠行第三脑室插管术后,分别行胃袖状切除术(SG)和胃旁路术(RYGB)。将脑室置管+胃袖状切除术(SG)大鼠和脑室置管+胃旁路术(RYGB)大鼠分别分成三组:生理盐水(NS)组、吗啉反义寡核苷酸(MON)组、受体抑制剂(SHU9119)组。造模后一周,每天固定时段,分别向预置导管中加入:NS,作为对照;MON,抑制下丘脑nesfatin-1表达;SHU9119,阻断黑皮质素3/4受体(MC3/4R)。观察大鼠摄食量及体重变化情况。大鼠给药10天后,取材,留取下丘脑,通过western blot测量下丘脑nesfatin-1、MC3/4R、ERK蛋白的变化。结果:1、高脂饮食喂养5周后,符合条件的肥胖大鼠体重为510±15 g。将其分为5组后喂养4周(非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组、假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组),我们发现假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠与非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组大鼠相比,体重明显下降(p<0.05),三组体重之间无明显差异,其中胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠体重下降速度在第1-2周明显快于第3-4周下降速度,假手术限制饮食组体重下降速度比较稳定,假手术高脂饮食组体重在第一周略下降后回升,非手术高脂饮食组体重无下降。胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠摄食量在第一周明显下降,之后缓慢回升,但始终低于非手术高脂饮食组和假手术高脂饮食组大鼠的摄食量(p<0.05),同时高于假手术限制饮食组大鼠的摄食量(p<0.05)。非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组大鼠摄食量无明显变化。2、非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组、假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠血清中nesfatin-1水平分别为15121±1172,15446±2248,18267±1742,19323±1354,和18191±1790(pg/ml)。5组脑脊液中nesfatin-1水平分别为267.4±39.7,267.5±40.4,403.6±29.1,389.9±50.3,和341.7±54.1(pg/ml)。无论在血清还是脑脊液中,假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组的nesfatin-1水平均高于非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组水平,差异有统计学意义(p<0.05),假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组之间无统计学差异,非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组之间无统计学差异。分别将5组大鼠血清和脑脊液nesfatin-1数值(pg/ml)与大鼠体重(g)做回归分析,发现血清nesfatin-1水平与体重呈负相关(r=-0.7911,p<0.0001),脑脊液nesfatin-1水平与体重呈负相关(r=-0.7757,p<0.0001)。3、通过western blot测非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组、假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠下丘脑内nesfatin-1、MC3R、MC4R、ERK、p-ERK的表达发现假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠下丘脑内nesfatin-1、MC3R、MC4R、p-ERK的表达明显高于非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组大鼠下丘脑内的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组之间的SD大鼠下丘脑内相应蛋白无明显差异。非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组之间的SD大鼠下丘脑内相应蛋白同样无明显差异。ERK在各组之间的表达无明显差异。4、通过RT-PCR测量各组SD大鼠下丘脑中nesfatin-1、MC3R、MC4R、ERK1和ERK2mRNA表达情况,显示假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组SD大鼠下丘脑内nesfatin-1 mRNA、MC3R mRNA和MC4R mRNA表达水平高于非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组大鼠下丘脑内的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。假手术限制饮食组、胃袖状切除组、胃旁路组之间的SD大鼠下丘脑内相应mRNA无明显差异。非手术高脂饮食组、假手术高脂饮食组之间的SD大鼠下丘脑内相应mRNA同样无明显差异。ERK1 mRNA和ERK2 mRNA在各组之间的表达无明显差异。5、在胃袖状切除术-脑室置管模型中,生理盐水(NS)组、吗啉反义寡核苷酸(MON)组、受体抑制剂(SHU9119)组SD大鼠在成模一周后连续给药10天(1次/天),统计大鼠摄食量发现:吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠摄食量较生理盐水(NS)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠摄食量较生理盐水(NS)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠摄食量较吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05)。统计大鼠体重发现:吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠体重较生理盐水(NS)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠体重较生理盐水(NS)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠体重较吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);给药吗啉反义寡核苷酸(MON)和受体抑制剂(SHU9119)后,手术后的摄食量及体重仍然较术前下降。Western blot测量大鼠下丘脑内nesfatin-1、MC3R、MC4R、ERK、p-ERK的表达发现:给药MON后,脑内nesfatin-1的表达下降,p-ERK的表达下降,其余指标无明显变化;给药SHU9119后,p-ERK的表达下降,且p-ERK的下降程度比给药MON后明显,其余指标无明显变化。6、在胃旁路术-脑室置管模型中,生理盐水(NS)组、吗啉反义寡核苷酸(MON)组、受体抑制剂(SHU9119)组之间各指标的变化情况与胃袖状切除术-脑室置管模型十分相似。在大鼠在成模一周后连续给药10天(1次/天),统计大鼠摄食量发现:吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠摄食量较生理盐水(N S)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠摄食量较生理盐水(NS)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠摄食量较吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠摄食量增加,差异有统计学意义(p<0.05)。统计大鼠体重发现:吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠体重较生理盐水(NS)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠体重较生理盐水(NS)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);受体抑制剂(SHU9119)组大鼠体重较吗啉反义寡核苷酸(MON)组大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05);给药吗啉反义寡核苷酸(MON)和受体抑制剂(SHU9119)后,手术后的摄食量及体重仍然较术前下降。Western blot测量大鼠下丘脑内nesfatin-1、MC3R、MC4R、ERK、p-ERK的表达发现:给药MON后,脑内nesfatin-1的表达下降,p-ERK的表达下降,其余指标无明显变化;给药SHU9119后,p-ERK的表达下降,且p-ERK的下降程度比给药MON后明显,其余指标无明显变化。结论:肥胖SD大鼠胃袖状切除术和胃旁路术术后下丘脑内nesfatin-1的升高是导致大鼠术后摄食量和体重下降的原因之一。其机制是由于术后下丘脑内nesfatin-1升高后,将信号通过MC3/4R传递,使p-ERK蛋白表达增加,而ERK1/2磷酸化信号的激活导致中枢系统产生厌食作用,进而控制体重。因此胃旁路术与胃袖状切除术术后均存在下丘脑nesfatin-1—MC3/4R—pERK1/2信号通路参与摄食及体重调节。