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目的建立金属硫蛋白2A(Metallothionein 2A,MT2A)上调及MT2A下调表达人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)模型。观察内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激模型细胞后炎症因子的释放、细胞凋亡、细胞增殖等情况,揭示MT2A在LPS损伤HUVECs过程中作用,为临床治疗脓毒症提供实验依据。方法(1)细胞培养与LPS损伤效应观察培养人脐静脉血管内皮细胞,显微镜下观察细胞形态;应用MTT法观察不同浓度LPS刺激HUVECs细胞后细胞抑制情况,并计算LPS半数抑制浓度;应用Hoechst染色观察不同浓度LPS处理的HUVECs凋亡情况。(2)构建MT2A重组质粒(p EGFP-N1-MT2A)根据目的片段的序列设计一对两端分别带有Xho I、Kpn I酶切位点的PCR引物,以含MT2A全长序列c DNA模板PCR扩增出目的DNA片段,对产物进行凝胶电泳并回收;应用限制性内切酶Xho I、Kpn I分别酶切的目的片段和载体p EGFP-N1,将酶切后的目的片段加入酶切后的载体中,并应用连接酶连接;转染连接质粒至感受态大肠杆菌(Dh5α)进行扩增,抽提DNA并经限制性酶切分析初步筛选出阳性重组质粒,对构建成功的阳性质粒进行进一步DNA测序鉴定。(3)模型细胞的建立和鉴定根据RNAi设计原则,设计si RNA干扰靶点序列并通过化学合成方式合成靶点序列;将构建好的重组质粒和合成好的si RNA靶点序列通过脂质体的方式瞬时转染HUVECs细胞,建立HUVECs细胞MT2A上调表达模型(记录为MT2A↑)和下调表达模型(记录为MT2A↓);各组细胞转染48小时后,分别收取细胞,提取细胞总RNA,并逆转录成c DNA,进行荧光定量PCR,检测各组模型细胞中MT2A基因水平表达情况;各组细胞转染48小时后,分别收取细胞,通过Western blot检测各组模型细胞中MT2A蛋白水平表达情况。(4)LPS对模型细胞的损伤效应观察通过ELISA法检测LPS刺激模型细胞后不同时相点(24h、48h)TNF-α、IL-6含量;LPS刺激模型细胞后MTT测定HUVECs细胞增殖率;LPS刺激模型细胞后Hoechst染色,倒置荧光显微镜下观察HUVECs细胞凋亡情况;LPS刺激模型细胞后,应用细胞划痕实验观察HUVECs细胞迁移情况。结果(1)细胞培养相差显微镜观察HUVECs细胞受LPS刺激后形态结构出现明显变化;通过MTT法检测细胞抑制率,计算出LPS的半数抑制浓度为119.4 ng/m L,同时随着LPS浓度增大细胞凋亡率增加。(2)构建重组质粒:成功扩增出MT2A基因ORF目的片段,通过与载体p EGFP-N1链接重组为p EGFP-N1-MT2A,经Xho I和Kpn I双酶切及测定序列证实p EGFP-N1-MT2A重组质粒构建成功。(3)模型细胞的建立和鉴定:将重组质粒和si RNA转染至HUVECs细胞中,应用荧光定量PCR观察到转染重组质粒p EGFP-N1-MT2A细胞MT2A m RNA水平明显高于空白对照组,转染MT2A si RNA细胞MT2A m RNA水平低于空白对照组,si RNA-2干扰靶点MT2A m RNA水平最低;应用Western blot法,检测到转染重组质粒p EGFP-N1-MT2A的细胞MT2A蛋白水平明显高于空白对照组,转染MT2A si RNA细胞MT2A蛋白水平低于空白对照组,证明MT2A上调表达细胞模型和MT2A下调表达细胞模型建立成功。(4)LPS对模型细胞的损伤效应观察应用ELISA实验,观察到MT2A↑组较MT2A↓组、对照组在24 h和48 h两个时相点IL-6、TNF-α分泌均显著减少(P<0.05),MT2A↓组较对照组在24 h和48h两个时相点IL-6、TNF-α分泌均显著增加(P<0.05);MTT实验观察到MT2A↑组细胞增殖率显著高于对照组和MT2A↓组(P<0.05);Hoechst染色观察到MT2A↑组细胞凋亡率明显低于对照组和MT2A↓组;细胞划痕实验观察到MT2A↑组细胞迁移速率显著高于空白对照组和MT2A↓组(P<0.05)。结论成功构建人脐静脉血管内皮细胞MT2A上调表达细胞模型和MT2A下调表达细胞模型,内皮细胞MT2A上调表达可降低LPS刺激导致的炎症因子释放,减少LPS刺激导致的细胞凋亡,促进细胞增殖,加快细胞迁移速度等作用,揭示MT2A在LPS损伤内皮细胞过程中具有调控炎症因子表达,促进细胞修复的作用。