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目的:1.观察玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜的治疗效应,通过检测外周血淋巴细胞亚群(CD3+CD4+CD8+T细胞亚群、CD4+CD25+Foxp3+T细胞亚群)的比例、大鼠鼻粘膜中NF-κB通路相关蛋白(p65、p-p65、IκB、p-IκB)的水平、大鼠鼻粘膜中细胞因子白介素4(IL-4)、白介素17(IL-17 α)及干扰素γ(IFN-γ)的蛋白水平初步阐明玉屏风颗粒治疗过敏性鼻炎的作用机制。2.观察poly(I:C)及组胺诱导人正常皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT)过敏模型,通过观察细胞形态、增殖及HaCaT中白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、线粒体丙酮酸转运载体1(MPCl)基因的表达水平探讨玉屏风颗粒对过敏性细胞模型损伤的保护作用及减少炎症介质释放的治疗效应。方法:1.将60只SD大鼠随机分为正常组(n=10)和造模组(n=50),模型组采用卵清蛋白(OVA)法造过敏性鼻炎模型,采取10mgOVA+30mgAL(OH)3+1ml生理盐水/只制成混悬液,腹腔注射,隔日一次,共7次;第15天开始,用含10%OVA的生理盐水滴鼻,每侧50 μl,连续7天;正常组大鼠用生理盐水代替OVA生理盐水溶液进行上述操作。观察滴鼻后30min大鼠行为学评分,造模成功后造模组按评分随机分成6组,每组10只,分别为模型对照组、氯雷他定组(1.8mg/kg)、玉屏风颗粒高剂量组(5.4g/kg)、玉屏风颗粒中剂量(2.7g/kg)、玉屏风颗粒低剂量组(1.35g/kg)。玉屏风颗粒各剂量组、阳性对照药按10ml/kg剂量灌胃给药,每天1次,持续4周,正常对照组及模型对照组给予蒸馏水。给药期间造模组及给药组均按10%OVA的生理盐水溶液滴鼻,每侧50 μl,隔日一次,正常组则用生理盐水进行平行操作。给药4周后,末次给药前12h禁食不禁水,末次给药后1h进行10%OVA的生理盐水溶液滴鼻,滴鼻后30min内麻醉大鼠,采集大鼠的外周血及鼻粘膜,用于后续流式细胞术及Western blog 等实验。2.HaCaT培养:高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清),培养条件为37℃、5%CO2。细胞生长覆盖面积大约70%-90%时进行传代操作,加入5%的胰酶消化至细胞浮动,加入培养基终止消化后离心,弃去上清液后用培养基重新悬浮细胞,后进行细胞计数、细胞铺板等操作。(1)MTT法检测玉屏风颗粒对HaCaT细胞增殖的影响根据细胞计数结果按1×104个/孔细胞数铺96孔板,培育24小时后,玉屏风颗粒按浓度 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0 μg/ml 分别加入孔中,培育24h后,弃去上层培养基,加入MTT溶液,培育6h,每孔加入DMSO使结晶溶解后,用酶联免疫检测仪在570nm下检测每组吸光度。分别按 poly(I:C)(20 μ g/ml)和 Histamine(40 μ mol/ml)分别加入诱导后再按浓度 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0 μ g/ml 加入玉屏风颗粒,培育24h后,弃去上层培养基,加入MTT溶液,培育6h,每孔加入DMSO使结晶溶解后,用酶联免疫检测仪在570nm下检测每组吸光度。(2)RT-qPCR法检测玉屏风颗粒对HaCaT细胞过敏模型细胞因子的mRNA水平的影响根据细胞计数结果按1 × 105个/孔细胞数进行铺6孔板,分为正常对照组、模型对照组、玉屏风颗粒高剂量组(100 μ g/ml)、玉屏风颗粒中剂量组(20 μg/ml)、玉屏风颗粒低剂量组(4 μg/ml),poly(I:C)组除正常对照组外每组加入40 μ g poly(I:C)造模,Histamine组除正常对照组外每组加入80 μ mol Histamine造模,培育24h,给药各组按浓度加入的玉屏风颗粒,每组平行三孔,加药后培育24h后收样,RT-qPCR 检测 IL-1 β、IL-6、IL-8、TNF-α、MPC-1 的 mRNA 水平。结果:(一)玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠动物行为学的影响玉屏风颗粒能有效改善过敏性鼻炎大鼠过敏症状,过敏性鼻炎大鼠经过4周玉屏风颗粒灌胃治疗后,通过动物行为学观察我们发现,造模前各组大鼠形态正常,毛发整洁光滑,活动及饮食均无异常。造模后,造模大鼠出现全身抓挠、烦躁好动、喜聚集、毛发凌乱并出现脱落、流涕喷嚏频率变高、甚至出现呼吸困难、精神萎靡。给药后,各个给药组大鼠喷嚏频率及强度减轻,行为学评分下降。造模1周与造模2周时,与正常对照组比较,模型对照组大鼠行为学评分有显著性差异(P<0.01);与模型对照组比较,各给药组大鼠行为学评分模型无明显降低(P>0.05)。给药1周时,与正常对照组比较,模型对照组大鼠行为学评分有显著性差异(P<0.01);与模型对照组比较,各个给药组显著降低(P<0.01);给药2-4周,与正常对照组比较,模型对照组大鼠行为学评分有显著性差异(P<0.01);与模型对照组比较,各个给药组显著降低(P<0.01)。(二)玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠外周血淋巴细胞亚群的影响1.玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠外周血CD3+CD4+CD8+细胞亚群影响流式细胞术结果显示,给药4周后,和正常对照组比较,模型对照组大鼠外周血中CD3+、CD3+CD8+细胞亚群比例明显上升(P<0.05),CD3+CD4+细胞亚群比例明显上升(P<0.01);与模型对照组比较,玉屏风颗粒高剂量组的CD3+细胞比例明显下降(P<0.01),氯雷他定组、玉屏风颗粒高、中剂量组CD3+CD4+细胞比例明显下降(P<0.01)玉屏风颗粒低剂量组CD3+CD4+细胞比例下调(P<0.05),玉屏风颗粒高剂量组的CD3+CD8+细胞比例明显下降(P<0.01)。2.玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群影响流式细胞术结果显示,给药4周后,和正常对照组比较,模型对照组大鼠外周血CD4+CD25+、CD4+Foxp3+、CD25+Foxp3+细胞亚群无明显变化;与模型对照组比较,玉屏风颗粒高剂量组的CD4+Foxp3+、CD25+Foxp3+细胞比例明显下降(P<0.01)。(三)玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜中NF-κB通路相关蛋白及细胞因子的影响1.玉屏风调控过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜组织组织NF-κ B信号蛋白表达:Western bolt检测结果显示,模型对照组大鼠鼻粘膜中的p-p65、p-Iκ B表达明显上升(P<0.05),与模型对照组相比,玉屏风高、中剂量组的p65含量明显下降(P<0.05),玉屏风高、中、低剂量组的p-p65含量显著下降(P<0.01),玉屏风颗粒高、低剂量组的Iκ Bα含量明显上升(P<0.01),玉屏风颗粒中剂量组的IκB α含量上升(P<0.05),玉屏风高、中、低剂量组的p-IκB α含量明显下降(P<0.05)。2.玉屏风调控过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜组织细胞因子表达Western Blot检测结果显示,给药4周后,与正常对照组相比,模型对照组大鼠鼻粘膜中的IL-4表达无统计学差异,IL-17α表达明显下降(P<0.05),IFN-γ表达明显上升(P<0.05),与模型对照组相比,氯雷他定组、玉屏风颗粒高、中、低剂量组IL-4蛋白水平明显下降(P<0.05),氯雷他定组、玉屏风颗粒高、中剂量组IL-17α含量明显上升(P<0.05),氯雷他定组、玉屏风颗粒高、中、低剂量组IFN-γ含量明显下降(P<0.05)。(四)玉屏风颗粒对HaCat细胞过敏模型细胞增殖和细胞因子的影响1.玉屏风颗粒对HaCaT细胞过敏模型增殖的影响MTT法检测检测显示,各实验组间两两比较结果显示玉屏风颗粒在100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml是对正常HaCaT细胞增殖起到促进作用(P<0.05);对poly(I:C)诱导的HaCaT细胞中,poly(I:C)对HaCaT细胞增殖有抑制作用(P<0.05),玉屏风颗粒在 100、50、25、12.5、6.25、1.5625、0.78125mg/ml 浓度下对HaCaT细胞起到保护作用(P<0.05);对Histamine诱导的HaCaT细胞中,Histamine对HaCaT细胞增殖有抑制作用(P<0.01),玉屏风颗粒在100、50、25、12.5、6.25/ml浓度下对HaCaT细胞起到保护作用(P<0.01)。2.玉屏风颗粒对HaCaT细胞过敏模型细胞因子表达的影响(1)RT-qPCR法检测玉屏风颗粒对poly(I:C)诱导HaCaT细胞过敏模型炎症因子mRNA水平的影响RT-qPCR结果显示,与正常对照组相比,poly(I:C)诱导后HaCaT细胞内的IL-1β、IL-8、TNF-α、MPC-1均有明显上升(P<0.01)。与模型组相比,氯雷他定组、玉屏风高剂量组、玉屏风中剂量组、玉屏风低剂量组的IL-1 β mRNA的表达均有明显下降(P《0.01);在IL-6的表达中,氯雷他定组(P<0.01)、玉屏风低剂量组(P<0.01)、玉屏风高剂量组(P<0.05)、玉屏风中剂量组(P<0.05)均出现下降;氯雷他定组、玉屏风高、中、低剂量组的IL-8、TNF-α mRNA的表达均有明显下降(P<0.01);玉屏风高、中、低剂量组的MPC-1 mRNA的表达均有明显下降(P<0.01)。(2)RT-qPCR法检测玉屏风颗粒对Histamine诱导HaCaT细胞过敏模型炎症因子mRNA水平的影响RT-qPCR结果显示,与正常对照组相比,Histamine诱导后HaCaT细胞内的IL-1β、MPC-1 有明显上升(P<0.05),IL-6、IL-8、TNF-α 有显著上升(P<0.01)。与模型组相比,玉屏风高剂量组IL-1 β mRNA的表达均有明显下降(P<0.01);在IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达中,氯雷他定组、玉屏风高、中、低剂量组均出现下降(P<0.01);玉屏风高、中剂量组MPC-1mRNA的表达均有明显下降(P<0.05),玉屏风低剂量组的MPC-1mRNA的表达均有明显下降(P<0.01)。结论:玉屏风颗粒的抗过敏作用是通过调控淋巴细胞分化,抑制鼻粘膜NF-κ B通路激活和减少细胞因子表达和分泌达到的。1.玉屏风颗粒可以明显改善过敏性鼻炎动物的过敏症状。2.玉屏风颗粒降低过敏性鼻炎大鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+Foxp3+、CD25+Foxp3+细胞亚群比例,起到抑制免疫反应。3.玉屏风颗粒抑制过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜中NF-κ B通路p65、p-p65、I κ B-α、p-I κ B的合成和激活,抑制下游蛋白的表达。4.玉屏风颗粒抑制过敏性鼻炎大鼠鼻粘膜中IL-4、IL-17、IFN-γ分泌,减轻鼻粘膜过敏症状。5.玉屏风颗粒下调HaCat过敏模型中的IL-1 β、IL-6、IL-8、TNF-α、MPC-1的表达。总之,玉屏风颗粒可通过调控NF-κ B信号通路,减少鼻粘膜局部炎症因子分泌,并抑制鼻粘膜的过敏反应,以及大鼠体内T-淋巴细胞亚群的分化,有效防治了过敏性鼻炎的病程发展,对过敏性鼻炎的发生和预防起到了重要作用,同时从HaCaT细胞过敏模型中说明,玉屏风颗粒可以有效减少过敏状态下细胞的死亡,以及抑制炎症细胞因子的表达,其干预效应仍有待进一步研究。