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本研究室初步建立了一个以bmp-2启动子为药物作用靶点、荧光素酶为报告基因的药物筛选模型,其通过测定模型荧光强度而间接反映药物上调活性,属瞬时转染细胞筛选模型。本论文以此为基础,从细胞量、转染方式、转染时PYJ质粒的DNA量与脂质体量的比例、转染后至检测荧光素酶表达量的最适时间等方面优化模型的筛选条件。
为了使模型更适合高通量筛选,且更为简便、经济、易于操作,我们将模型从瞬时转染模型改建为稳定转染模型。然后对稳定转染模型的细胞量、药物作用时间等进行了优化。通过对比瞬时转染模型和稳定转染模型,我们发现后者可完全取代前者,且更经济、节约实验成本和实验时间,荧光素酶表达测量值更稳定,变异系数更易控制在10%以下。
利用原模型和改进的稳定转染模型,我们筛选了5000个微生物发酵液粗提品,500个合成化合物,对初筛阳性物进行五次复筛,选出高上调率的2个阳性合成化合物2009481、2009111和1株稀有放线菌5195。通过半定量RT-PCR验证了2009111可促人MG63细胞的BMP-2mRNA的表达。用流式细胞分析技术也检测到2009481、2009111可在蛋白水平促人MG63细胞的BMP-2表达。2009481为蒽酮类化合物,2009111为红景天甙类化合物,为抗骨质疏松药物的研发提供了新方向,其药理和毒理活性值得进一步研究。
对稀有放线菌5195进行扩大发酵、提取分离得到5195的活性组分,并测得其活性组分浓度在3μg/mL左右能较大幅度提高筛选模型的荧光活性。5195可在蛋白水平促人MG63细胞的BMP-2表达,上调率高达74.71%,这为5195的进一步研究提供重要依据。