研究背景和目的HMGA2是高迁移率蛋白(high mobility group,HMG)家族成员,是一种小分子核染色质结合蛋白。HMG家族因其成员分子量较小,可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而得名。其蛋白氨基端含有3个短的基础重复序列编码结构域,能与DNA分子小沟内的A-T丰富区结合,称之为AT-hooks结构。HMGA2本身没有转录活性,但可作为构筑因子,与DNA结合并改变其空间结构,通过复杂的蛋白-DNA、蛋白-蛋白相互作用网络,统筹核蛋白复合物的装配,从而调控多种基因转录。HMGA2在人体正常生长发育中发挥重要作用。胚胎发育过程中,各组织广泛且高表达HMGA2,而在大多数正常成人组织则无表达或低表达。研究发现,多种良恶性肿瘤包括血液系统肿瘤均存在HMGA2过度表达或基因重排后的异常表达,引起了人们对HMGA2在肿瘤发生发展过程中所起作用的关注。多项体内外实验显示了HMGA2的致癌活性,而阻断其表达则可能抑制肿瘤生成。例如在逆转录病毒作用后的鼠甲状腺细胞中,只有发生恶性转化的细胞中能测得HMGA2表达;在表达全长或截短型HMGA2的转基因小鼠中可观察到数种良性肿瘤生成;在鼠甲状腺细胞株FRTL5中转染HMGA2反义载体,再与骨髓增殖性肉瘤病毒或柯斯顿鼠肉瘤病毒等作用后发现,与未转染反义载体或转染正常HMGA2的细胞相反,细胞未能在软琼脂培养基上增殖,也未能在裸鼠中转化成肿瘤。目前认为,HMGA2参与肿瘤发生发展的机制包括:①抑制DNA修复系统激活,包括与核苷酸切除修复基因ERCC1的启动子结合并抑制其活性、直接抑制DNA双链断裂的修复信号通路的激活等。②通过多种途径干扰正常细胞周期,如与pRB/E2F1复合物结合,通过替换组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1),增强E2F1及DNA结合组蛋白乙酰化,诱导并增强E2F1活性,促使细胞进入S期并增殖。③通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用诱导肿瘤发生。最近研究发现,可由TGF-β通过smad途径诱导HMGA2从而触发EMT。④染色体重排导致HMGA2的3′-非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)缺失。截短型HMGA2失去其位于3′UTR的多标记位点,无法与let-7等microRNAs结合,从而失去microRNA对HMGA2表达的抑制作用,最终诱发肿瘤。HMGA2在血液系统肿瘤中研究较少,最初有学者利用常规RT-PCR方法在慢性髓系白血病及急性髓系白血病患者的外周血、健康志愿者及上述患者的CD34阳性造血干细胞中检测到HMGA2表达,研究者认为HMGA2在白血病患者中的表达可能是由于异常造血干细胞增殖导致,并有可能成为检测某些类型白血病的敏感标志。染色体12q13-15区重排在发生Richter转化的慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、骨髓纤维化伴骨髓化生、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病等患者中有报道,利用FISH等研究发现存在涉及HMGA2的重排,进一步观察认为发生HMGA2重排的患者大多数预后不佳。最近Meyer等首次定量检测了CML患者HMGA2基因表达水平,发现在1例CML加速期(CML-accelerated phase,AP)及1例急变期(CML-blastic phase,BP)患者中,HMGA2基因表达水平与慢性期(CML-chronic phase,CP)患者相比较高,推测可能是由于白血病细胞过度增殖导致。CML是起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病,费城染色体及bcr/abl融合基因为其恶性克隆标志。t(9;22)(q34;q11)染色体异位形成bcr/abl融合基因。目前认为,bcr/abl融合基因编码的P210蛋白具有异常增高的酪氨酸激酶活性,可导致下游一系列信号持续磷酸化,产生造血干细胞增殖失控、凋亡受阻、黏附功能缺陷等病理生理改变,是CML发病的主要原因。CML发病可分为CP、AP及BP,CML-CP病情较为隐匿,而进入AP/BP后,患者往往对治疗反应差,病情进展迅速。CML急变往往伴有bcr/abl融合基因表达增高,PTK活性增强。急变机制目前仍未完全清楚,现普遍认为,CML急变涉及基因组不稳定性、分化障碍、端粒缩短及抑癌基因失活等,是一个涉及多基因、多途径的复杂过程。为了探讨HMGA2与CML发展过程的联系,我们选取处于不同进展时期的CML患者外周血为研究对象,采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR,对HMGA2的表达进行相对定量分析。研究方法:(一)实验材料收集2006年1月至2008年2月南方医科大学附属南方医院血液科的24例CML患者外周血标本。24名患者中位年龄39.5岁(18-63),男性14例,女性10例。其中CML-CP12例,CML-AP/BP12例。5份正常对照外周血标本取自南方医院检验科。(二)实验方法1.骨髓血细胞形态学检查及染色体核型分析。2.FISH检测bcr/abl融合基因阳性细胞百分数。3.实时荧光定量PCR检测HMGA2基因的转录水平。①分别设计和合成HMGA2及内参照基因GAPDH的引物及探针。②患者外周血标本采集和外周血中单个核细胞提取。③单个核细胞中RNA提取。④逆转录反应合成cDNA。⑤常规PCR反应,PCR产物构建质粒标准品。⑥实时荧光定量PCR方法相对定量检测HMGA2基因转录水平。(三)统计学分析根据数据资料性质,CML-CP与CML-AP/BP患者HMGA2转录水平差异利用秩和检验比较,HMGA2转录水平和bcr/abl融合基因水平相关性分析采用Spearman方法;HMGA2转录水平和患者外周血白细胞及原幼细胞水平相关性分析采用Spearman方法。P＜0.05认为差异有统计学意义。研究结果:1.CML-AP/BP患者HMGA2的转录水平与CML-CP患者之间差异有统计学意义(Z=-4.157,P＜0.01)。CML-CP患者与正常对照者转录水平差异无统计学意义(Z=-1.160,0.246)。2.CML患者HMGA2转录水平与bcr/abl融合基因水平之间不存在正相关关系(r_s=0.078;p=0.471)。其中CML-AP/BP患者HMGA2转录水平与bcr/abl也没有相关关系(r_s=0.058;P=0.736)。3.CML患者HMGA2转录水平与其外周血白细胞数无相关关系(rs=-0.067;P=0.654)。而在CML-AP/BP患者中,HMGA2转录水平与外周血原幼细胞数(通过外周血血常规白细胞数与血涂片原幼细胞百分比的乘积表示)呈正相关关系(r_s=0.636;P=0.017)。初步结论:1.HMGA2基因转录水平与CML疾病进展时期相关,CML-AP/BP患者转录水平显著高于CML-CP患者。说明HMGA2可能在CML疾病进展过程中发挥作用,具体机制有待进一步研究。2.HMGA2基因转录水平与bcr/abl阳性细胞百分比之间无相关关系,提示在CML疾病进展过程中,HMGA2与bcr/abl可能通过不同途径发挥作用。3.CML-AP/BP患者中,HMGA2转录水平与外周血原幼细胞水平呈正相关关系。提示HMGA2表达可能和CML原始幼稚细胞增殖有关,是否可用以监测疾病进展,观察治疗效果,判断预后还有待进一步研究。创新点:目前尚未见文献报道对CML患者HMGA2转录水平进行相对定量分析,得出部分新的结论:CML-AP/BP患者HMGA2转录水平显著高于CML-CP患者;HMGA2转录水平与bcr/abl阳性细胞百分比无相关关系,CML-AP/BP患者中,HMGA2转录水平与外周血原幼细胞水平呈正相关关系。