随着全球气候的变暖,外界环境温度过高造成的热应激逐渐成为影响我国养殖业的一大因素。因此,加强对热应激损伤的研究迫在眉睫。热应激是当外界环境温度超过机体适宜温度时机体所表现出的非特异性生理反应,对动物的生产性能、免疫机能、繁殖机能都有不同程度的影响。机体在受到热应激过程中会产生一组特殊的蛋白质-热休克蛋白。热休克蛋白是一组广泛存在于细胞内、能够协助蛋白质的折叠及变性蛋白质的恢复的保守性蛋白。Hsp60作为热休克蛋白家族中一个重要成员,其主要分布于线粒体内。研究发现Hsp60在心血管疾病、缺血性损伤方面起着重要的保护作用。本文的主要研究目的是来了解热应激过程中Hsp60表达量的变化对大鼠心肌细胞的影响,为进一步了解Hsp60在热应激过程中的保护作用提供理论依据。针对大鼠Hspd1基因的保守区序列分别设计4对siRNA,同时设计1对和mRNA没有明显同源性的siRNA序列作为阴性对照,经酶切及测序鉴定成功构建了Lenti-siRNA-GFP重组慢病毒载体。将构建的重组慢病毒干扰质粒与慢病毒包装系统的2个辅助质粒共转染293T细胞进行重组慢病毒假病毒包装并浓缩获得重组慢病毒。将获得的浓缩的重组慢病毒侵染H9C2细胞,加入1μg/mL嘌吟霉素抗性筛选,获得具有抗性的细胞。对抗性细胞进行单克隆筛选并用荧光定量PCR和Western Blotting的方法验证干扰效率。将干扰效率最高的单克隆进行传代,传至第20代,并且应用荧光定量PCR和Western Blotting的方法检测第5、10、15、20代的细胞Hsp60蛋白及其基因的表达水平,结果显示,每代细胞基因组Hsp60都呈现低表达,证明成功建立了稳定低表达Hsp60的细胞系。研究发现,热应激条件下H9C2凋亡率明显增多,坏死率却未明显变化。通过TMRE和MitoSOXTM检测线粒体膜电位(△(?))和线粒体ROS的变化,结果表明,低表达Hsp60导致线粒体膜电位下降和产生更多的线粒体ROS。线粒体膜电位的变化反映了线粒体内膜的变化,进一步实验中,检测发现两组细胞中,CypD,ANT,PIC的基因表达量也为明显变化。但是,热应激过程中伴随bax从胞质中转移到线粒体内。我们猜想Hsp60是通过线粒体外膜而非内膜来参与细胞的抗凋亡作用。