研究背景和目的:随着科技的发展和人们生活水平的不断提高,个人移动通讯设备被广泛使用,射频电磁辐射(RF-EMF)可能带来的种种不良效应和安全隐患越来越被大众所关注。研究表明,神经系统是电磁辐射暴露受累的重要靶点,而神经元Ca2+调节失衡与多种神经系统损害相关,因此射频电磁辐射与钙平衡的关系研究已成为近年来该研究领域关注的方向。射频电磁辐射引起细胞内钙调节失衡的报道很多,但射频电磁辐射诱导钙失衡的完整机制还不清楚,在神经元细胞膜钙离子通道途径研究射频辐射致胞内钙失衡的机制报道甚少。为此,本研究拟从瞬时受体电位C(TRPC)通道和电压门控通道(VGCC)途径,探讨RF-EMF对神经元钙平衡的影响和发生机制,以期为电磁辐射致神经损害的机制研究提供更多线索和参考。方法:(1)原代培养皮层神经元(PCCNs)和分组:原代皮层神经元取自0-3天龄新生大鼠大脑,胰酶消化后培养8天进行实验。实验分组:假暴露组、电磁辐射暴露组、假暴露+SKF-96365处理组、电磁辐射暴露+SKF-96365处理组。SKF-96365为TRPC通道阻断剂。(2)神经元电磁辐照暴露模型:暴露系统为sXc-1800,频率1800 MHz,比吸收率4 W/kg,5min开、10 min关,连续暴露。(3)RF-EMF暴露后神经元死亡率和活力检测:采用LDH和CCK-8试剂盒,分别检测暴露结束时和结束后24 h PCCNs的死亡率和活力。(4)RF-EMF暴露对神经元突起生长影响观察:β-III微管蛋白(Tuj-1)免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜检测RF-EMF暴露后神经元突起生长状况,并通过在暴露前加入TRPC通道阻断剂SKF-96365预处理,观察比较阻断TRPC通道后RF-EMF暴露对神经元突起生长的影响。(5)TRPC1、TRPC3蛋白表达检测:采用Western blot检测RF-EMF暴露12、24、48 h PCCNs中TRPC1、TRPC3通道蛋白表达水平。(6)检测[Ca2+]i变化:Fluo-4 AM染色,共聚焦显微镜测RF-EMF暴露24 h结束时,PCCNs钙库操纵性钙内流(SOCE)和K+诱导钙内流的变化。(7)膜片钳全细胞技术vgcc电流检测:rf-emf暴露24h结束时,施加不同电压激活通道开放,全细胞模式记录pccnsvgcc电流。结果:(1)rf-emf暴露结束时和结束后24h,辐照组pccns死亡率和活力检测结果与相应对照组相比均无显著差异(p>0.05)。说明本实验中的电磁辐射剂量未对神经元存活和活力造成明显影响,可作为后续实验研究的电磁暴露模型。(2)rf-emf暴露24h,pccns中trpc1和trpc3蛋白表达分别降低24%和23%,且与对照组相比有统计学意义(p<0.05)。说明trpc通道蛋白表达受抑,由此可能造成通道功能受损。(3)skf-96365处理可使假暴露组pccnssoce下降24%,rf-emf暴露24h,pccns的soce下降54%,两者与对照组比差异均有统计学意义(p<0.05)。rf-emf暴露+skf-96365联合处理组soce下降20%,该变化与单纯rf-emf暴露组比较差异无统计学意义(p>0.05)。说明加入skf-96365并未有效增强rf-emf暴露引起的soce下降效应,间接提示rf-emf引起trpc通道介导钙内流途径受损参与rf-emf对神经元soce的抑制。(4)rf-emf暴露48h可引起pccns突起总长度、初级突起数和分支数分别下降20%、12%、31%,与假暴露组相比有统计学意义(p<0.05)。假暴露skf-96365处理组,突起总长度、初级突起数、分支数分别下降10%、12%、24%,与假暴露组比较变化均有统计学意义(p<0.05),而暴露skf-96365联合处理组突起总长度、突起数、分支数的变化与暴露组比较差异无统计学意义(p>0.05)。说明rf-emf暴露引起pccnstrpc通道受损造成的钙平衡失调,可引起神经元突起生长受抑。(5)rf-emf暴露24h,不同电压诱导的高阈值激活vgcc电流大小和电流密度与假暴露组相比,差异没有显著意义(p>0.05)。说明本实验模型下rf-emf暴露对pccnsvgcc的激活未见影响。(6)rf-emf暴露24h,k+诱导的pccns钙内流升高与假暴露组相比降低了26%,且有统计学差异(p<0.05)。加入tg处理后,k+诱导的神经元钙内流升高与假暴露组相比没有显著差异(p>0.05)。说明rf-emf暴露对vgcc介导钙内流的功能没有影响,但对胞内调控钙内流通路有影响。结论:在本实验电磁辐射暴露模型下,rf-emf连续暴露24h,造成trpc1、trpc3蛋白表达降低,导致神经元soce减少,神经元钙动力特性改变;本实验模型下未观察到rf-emf暴露24h对高阈值激活vgcc电流特性和vgcc介导钙内流功能的影响,但是会通过对胞内调控钙内流途径的影响,造成K+诱导的神经元钙动力特性改变。我们发现,在RF-EMF对TRPC和VGCC途径影响的研究中,均观察到了PCCNs钙动力特性的改变,虽然引起的途径不同,但这可能就是造成原代皮层神经元突起生长减缓的影响机制之一。