苦丁茶抑菌活性及其红外谱效关系研究

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目的:本课题以广西苦丁茶作为研究对象,考察苦丁茶不同极性部位对革兰氏阴性菌、阳性菌的抑制作用,确定苦丁茶抑菌活性的药效部位,为研究苦丁茶抑菌活性成分提供依据;利用响应面分析法,以苦丁茶水提物抑菌活性为指标,对苦丁茶水提物的提取工艺进行了优化;研究苦丁茶中抑菌活性成分不同采收月份的动态累积规律,为确定适宜的采收期、合理开发利用其植物资源提供科学依据;同时将苦丁茶红外指纹图谱与抑菌活性之间的谱效关系,以阐明相关物质基础,建立一种操作简便、客观有效的评价苦丁茶内在质量的新模式。  方法:(1)采用系统溶剂提取法得到7个不同极性部位,通过96孔板测定不同极性部位的最低抑菌浓度(MIC),杯碟法测定其抑菌圈直径,并通过HPLC分别测定其中槲皮素、山柰素含量,苯酚硫酸法测定多糖含量,分析3种物质含量与抑菌能力之间的关系,并确定苦丁茶抑菌活性物质的提取方法。(2)在单因素试验基础上,选择提取温度、提取时间和液料比三因素为自变量,以杯碟法测定苦丁茶水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌圈直径为响应值,根据中心组合(Box-Behnken)试验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法优化苦丁茶抑菌活性成分提取工艺研究。(3)不同采收期的苦丁茶叶水浴回流提取3次,用杯碟法分别测定其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌3种菌的抑菌圈直径,比较不同采收期苦丁茶水提物抑菌圈直径大小,确定最佳采收期,通过苯酚硫酸法测定不同采收期苦丁茶提取物中多糖含量,分析多糖含量与苦丁茶抑菌能力之间相关性。(4)采用近红外漫反射光谱技术,以不同产地苦丁茶为样本,建立不同产地苦丁茶水提物的红外指纹图谱库,并测定苦丁茶水提物对革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌的抑菌活性,运用数理统计方法将药理数据与红外指纹图谱进行相关性研究,建立相关性回归模型。  结果:(1)不同极性部位抑菌结果显示石油醚无抑菌活性,氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物抑菌活性中等,乙醇、甲醇抑菌活性强,水提取物的抑菌活性最强。通过3种物质含量与苦丁茶抑菌能力之间相关性比较推测槲皮素、多糖类为苦丁茶抑菌活性成分。(2)苦丁茶水提物中抑菌活性成分提取的最佳工艺条件为︰回流提取、提取温度98℃、提取时间2.4h、料液比1︰60 g·mL-1。在此条件下提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌圈直径达20.37mm、24.83mm、29.35mm。(3)在一年的不同月份生长期内,苦丁茶水提物对3种菌的抑制作用均有显著性差异,4月份苦丁茶水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑菌圈直径为全年最大值,12月份苦丁茶水提物的抑菌圈直径为全年最小值。苦丁茶抑菌活性成分4月份含量最高,为最佳采收期。苷类和多糖为苦丁茶抑菌活性成分。(4)采用后退法建立多元线性回归方程,红外光谱中19个指纹峰,有15个对大肠杆菌的关系方程有显著贡献(P<0.05),大肠杆菌的谱效关系式为:Y=-111.436-144.584 X1+97.856 X3+96.027 X4+64.34 X5-83.72 X6-118.229 X7+141.886 X8-25.663 X9-12.12 X10+19.58 X11-12.098 X12+33.067 X13+31.289 X15+46.206 X16(P<0.05, R=0.952)有11个对金黄色葡萄球菌的关系方程有显著贡献,金黄色葡萄球菌的谱效关系式为:Y=24.862-72.355 X1+168.465 X3-75.447 X7+132.753 X8-15.572 X12+53.171 X13+14.905 X14+37.644 X15+48.743 X16+3.335 X17+18.88 X19(P<0.05,R=0.926)有12个对绿脓杆菌的关系方程有显著贡献,绿脓杆菌的谱效关系为:Y=137.561-315.929X2+400.182X3-157.634X5-30.459X6+72.051X8+5.023 X10-30.016 X11-53.736X12+162.242X13-146.465X14(P<0.05, R=0.952)经过7批药材验证,谱效关系模型的预测值和实际值的偏差率不超过10%,表明谱效关系式可用于预测苦丁茶药材的抑菌药效作用。  结论:(1)苦丁茶水提取物的抑菌活性最强,槲皮素、多糖类为苦丁茶抑菌活性成分。(2)建立的数学模型能很好的预测各因素同提取率之间的关系。(3)苦丁茶抑菌活性成分4月份含量最高,为最佳采收期。苷类和多糖为苦丁茶抑菌活性成分。(4)利用近红外漫反射光谱法测定苦丁茶内在抑菌品质是可行的,为苦丁茶抑菌能力的检验提供了新的方法模式。
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