前期研究表明,水通道蛋白4(aquaporin4, AQP4)基因敲除能够增强吗啡(morphine, Mor)的镇痛作用,同时能够减轻机体对Mor的耐受。本研究旨在进一步观察AQP4基因对Mor所致精神和躯体依赖的影响,并初步探讨AQP4基因影响Mor药理作用的阿片系统机制。　　为了评价AQP4基因敲除对Mor所致精神依赖的影响,利用野生型(wild-type, WT)及AQP4基因敲除型(knock-out, AQP4-KO)小鼠,观察了Mor诱发的条件性位置偏爱(conditioned place preference, CPP)效应的形成和自然消退。本试验采用非偏性抗衡设计,对照组给予生理盐水(normal saline, NS, s.c,0.1mL/10g)后非伴药箱训练,其余各组动物分别给予Mor(1、3和10mg/kg, s.c)后伴药箱训练。连续训练8天后测试结果显示:WT及AQP4-KO小鼠盐水对照组都没用CPP形成,二者的白箱停留时间分别是376.03±28.02s和401.84±74.12s,无统计学差异;而Mor组的WT及AQP4-KO小鼠均形成CPP,与各自对照组比较都有显著性差异(P<0.01, t-检验)。其中WT小鼠的三个Mor剂量组伴药箱停留时间分别是433.07±57.47s,476.92±89.81s,492.95±90.32s;AQP4-KO小鼠的三个Mor剂量组伴药箱停留时间分别是516.55±79.04s,547.11±93.41s,499.5±59.05s。然后将动物放回原处饲养,每隔一周重复测量一次,直至CPP效应的消退。本部分结果表明,AQP4基因敲除后能促进低剂量Mor诱发的CPP效应的形成,但没有影响该CPP的自然消退过程。　　在躯体依赖试验中,WT和AQP4-KO两种小鼠Mor组连续五天递增给药(Day1,30 mg/kg;Day2,40 mg/kg;Day3,50 mg/kg;Day4,60 mg/kg;Day5,70 mg/kg.s.c.一日三次);两种小鼠对照组给予NS(s.c,0.1mL/10g)。末次给药6h后,予以纳洛酮(10 mg/kg, i.p)催促,WT小鼠呈现典型的Mor躯体依赖戒断综合征。WT小鼠盐水组和Mor组的跳跃次数分别是1.67±1.89次和41.67±24.05次,二者间差异显著(P<0.01,t-检验)。而AQP4-KO小鼠盐水组和Mor组的跳跃次数分别是3.17±3.26次和8.50±7.97次,无显著性差异。该结果提示AQP4基因敲除参与了Mor躯体依赖的形成过程。　　目前大多数神经生物学者认为机体主要通过阿片系统和非阿片系统在受体前、受体和受体后三个水平上对阿片类药物产生神经适应性调节(neuroadaptation)。所以,AQP4基因影响Mor依赖等上述药理作用的机制探索也应着眼于此。本研究在 AQP4-KO与 WT小鼠的阿片系统三个水平上分别选取代表性指标,初步探索吗啡长期处理后两种小鼠的神经适应性改变的异同,以期获得AQP4基因影响Mor依赖等药理作用的内在原因。　　前额叶皮层、海马、纹状体和下丘脑是与Mor药理作用密切相关的脑区,本研究利用放射免疫法测定这些脑区中β-内啡肽(β-endorphine,β-EP)含量。结果显示,在生理状态下,WT与 AQP4-KO小鼠四个脑区中β-EP的表达没有明显差异,其表达量分别是802.82±178.84ng/mg protein和787.60±238.28ng/mg protein(前额叶皮层);1034.62±267.98ng/mg protein和886.96±231.59ng/mg protein(海马);779.28±198.47ng/mg protein和658.34±130.67ng/mg protein(纹状体);1508.92±356.88ng/mg protein和1645.34±560.35ng/mg protein(下丘脑)。而Mor长期处理后(给药方式同躯体依赖实验),WT小鼠这四个脑区中β-EP含量显著降低(P<0.01,t-检验),盐水组和Mor组的β-EP含量分别是802.82±178.84ng/mg protein和645.38±127.36ng/mg protein(前额叶皮层);1034.62±267.98ng/mg protein和721.27±232.93ng/mg protein(海马);779.28±198.47ng/mg protein和559.11±104.61ng/mg protein(纹状体);1508.92±356.88ng/mg protein和936.28±158.32ng/mg protein(下丘脑)。但在AQP4-KO小鼠,仅前额叶皮层β-EP含量显著升高,盐水组和Mor组的β-EP含量分别是787.60±238.28ng/mg protein和1021.14±187.20ng/mg protein,具有显著性差异(P<0.05,t-检验)。海马、纹状体和下丘脑等其它脑区盐水组和Mor组的β-EP含量没有显著差异。这些结果提示 AQP4基因敲除对小鼠脑内β-内啡肽的含量没有影响,但能够对抗Mor长期处理所致的β-内啡肽含量降低。　　利用放射性配体受体结合试验,对 WT与 AQP4-KO小鼠全脑内阿片受体特性进行检测。在生理状态下,WT与 AQP4-KO小鼠的Kd分别是0.27±0.03nM和0.44±0.04nM,而Bmax值分别是0.40±0.04pmol/mg protein和0.66±0.04pmol/mg protein,均有显著性差异(P<0.01,t-检验)。Mor处理之后(给药方式同躯体依赖实验),WT小鼠阿片受体亲和力显著下降(P<0.01,n=4-6,t-检验),Kd值从0.27±0.03nM上升到0.40±0.04nM;但是最大结合容量没有显著变化。AQP4-KO小鼠阿片受体的特征改变与WT小鼠相似,Kd值从0.44±0.04nM增加到0.64±0.08nM,Bmax值保持不变。这些结果表明 AQP4基因敲除后,小鼠全脑中阿片受体的亲和力显著降低,而受体最大结合容量却显著增加;而Mor长期处理后阿片受体特征的改变不受AQP4基因敲除的影响。　　利用放射免疫法,进一步测定了AQP4基因敲除对前额叶皮层、海马、纹状体和下丘脑四个主要脑区受体后主要信号分子环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量变化率和腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)活性的影响。在生理状态下,与WT小鼠相比,AQP4-KO小鼠各脑区cAMP含量变化率和AC活性没有显著差异。Mor慢性应用后(给药方式同躯体依赖实验),WT小鼠海马区和纹状体的cAMP含量变化率和AC活性显著改变(P<0.01,t-检验),而其它脑区无显著变化。在海马,盐水和Mor组的cAMP含量变化率分别是(41.50±9.28)％和(61.22±7.85)％;AC活性分别是178.80±35.96pmol/mg·min和283.35±62.56pmol/mg·min;在纹状体,盐水和Mor组的cAMP含量变化率分别是(43.98±6.18)％和(56.93±11.08)％;AC活性分别是183.64±43.63pmol/mg·min和276.00±96.38pmol/mg·min。AQP4-KO小鼠各脑区的cAMP含量变化率和AC活性都没有显著改变。以上结果说明AQP4基因敲除后,小鼠脑内阿片受体的功能及AC活性没有显著变化;而AQP4基因敲除能够对抗Mor长期处理导致的AC活性增强。　　总之,本研究首次探讨了AQP4基因与Mor依赖之间的关系。在正常生理状态下,与WT小鼠相比较,AQP4-KO小鼠脑内阿片受体系统在受体前β-EP含量没有显著改变;在受体特征上表现出受体亲和力下降和结合容量增加;受体后AC活性没有显著性差异。Mor长期应用后,AQP4-KO小鼠在受体水平的变化与 WT小鼠保持一致,但受体前、受体后都有不同的神经适应性改变。这些结果部分解释了AQP4基因对Mor药理作用的影响机制,进一步深化了人们对星形胶质细胞影响药物依赖的认识,也为药物依赖的研究提出了新问题、开拓了新领域。