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研究背景骨肉瘤是一种骨原发恶性骨肿瘤,约占恶性骨肿瘤的35%,好发于儿童和青少年。虽然目前骨肉瘤诊断与治疗的手段随着医疗技术的发展日新月异,但是在积极手术和化疗的情况下全球的骨肉瘤患者5年总体生存率仍然没有明显的提高。随着研究的深入,发现骨肉瘤细胞具有非常强的侵袭和增殖的能力。骨肉瘤患者在临床确诊时,80%的人往往已经发生肺部微转移。而作为骨肉瘤细胞侵袭能力的基础是细胞异常的快速增殖。因此,进一步探讨骨肉瘤细胞增殖的机制对骨肉瘤的积极治疗具有深远的意义。钙离子(Ca2+)作为细胞内最普遍的第二信使,在细胞内分布范围最为广泛,其生物学功能也非常重要。细胞内Ca2+的作用既有包括一些短期效应,如神经元细胞的电兴奋性、胰腺细胞的分泌和肌细胞的收缩等作用,也有包括许多重要的长期效应,如调控基因转录和翻译、细胞迁移、分裂及生长等。其发挥作用的基础主要是钙离子作为细胞核内、胞质、细胞器的多种酶激活或失活的重要因子。胞内钙离子发挥作用的机制首先是通过与钙调蛋白结合,然后依次调控不同的激酶、环化酶、磷酸酶、酯酶及其他的离子通道的开放或关闭等发挥效应,在调控细胞周期、分化、增殖和凋亡中有非常重要的作用。进一步的研究发现,当细胞内Ca2+升高时,可以激活蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC),进而激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK),也能促进核转录因子(nuclear factor-kappa B, NF-kB)转入到核内,调控相关蛋白表达。核转录因子(nuclear factor-kappa B, NF-kB)是一种重要的转录因子蛋白,在大多数肿瘤细胞中都表现出活性增高。多种致癌因素可通过激活NF-kB途径促进细胞生长,使细胞发生恶性转化并促进肿瘤细胞的转移等。抑制NF-kB活性可以抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、增加抗肿瘤细胞对化疗的敏感性、抑制炎症、减少肿瘤血管生成。ERK是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的重要的组成成分,是介导细胞增殖效应中重要的细胞内信号转导途径。研究表明,磷酸化的ERK可以促进许多核转录因子(如核因子kappa-B, NF-kB和活化剂蛋白1,AP-1等)的表达(NF-kB和AP-1可以单独或者协同其他蛋白来调节细胞的分化、增殖及凋亡),并且也能调节肿瘤细胞转移和侵袭等的相关蛋白(如基质金属蛋白酶,MMPs和尿激酶型纤溶酶原激活物,u-PA等)的表达；同时发现,激活后的ERK可促进细胞周期关键蛋白D1(cyclin D1)的表达,并抑制细胞周期抑制蛋白p27的活性,从而促进细胞增殖；更重要的是,磷酸化的ERK能够上调bcl-xL和bcl-2的表达,而抑制细胞的凋亡。因此,Jin等认为,抗肿瘤药物的作用机制可能是通过改变ERK的活性来发挥作用的。由此可见,ERK和NF-kB是细胞生存和增殖必不可少是两个重要蛋白,也是肿瘤细胞增殖所必须的,而它们的活性是受到细胞内Ca2+浓度调节。胞内钙Ca2+水平受多种机制的调节,包括细胞膜离子通道、离子交换、离子泵及来自于内质网和核内储钙的释放等。在非极性细胞,人们越来越关注钙库调控的钙内流(store operated calcium entry, SOCE)在细胞内Ca2+浓度调节中的作用。在非极性细胞中,促进细胞生长的因子能够激活细胞膜表面受体,进而活化膜下PLC (phospholipase C), PLC作用于PIP3使其分解为IP3和DAG,IP3与内质网膜上IP3R受体结合,使Ca2+从内质网释放进入胞质。随着胞内钙库的排空,内质网膜上的Ca2+。传感器”STIM1(Stromal interaction molecule1,基质相互作用因子1)的EF手性(EF-hand)结构域能够感受内质网内Ca2+的降低,然后STIM1聚集形成“斑”状结构并向细胞膜移动,然后与细胞膜上的Ca2+通道Orail结合,促进其开放,使细胞外的钙离子进入细胞内,这个过程被称为钙库调控的钙内流(SOCE),其通道称为钙库调控的钙通道(store operated calcium channel, SOCC)。可见,SOCE作为非极性细胞调控细胞Ca2+内流的重要机制,对细胞增殖等生理活动有重要作用。STIM1蛋白是识别内质网腔中Ca2+竭耗,同时是质膜上钙通道介导的胞外Ca2+内流的关键分子。STIM1蛋白C端位于细胞胞质内,N端位于内质网腔内。STIM1蛋白由5个主要的功能结构域组成,其中位于N端并且插入内质网腔内的结构域称为不成对的EF-hand结构域,其主要功能识别内质网腔内的Ca2+浓度变化；靠近C端的结构域有大量脯氨酸富集,目前认为其功能可能是直接或辅助C端与Orail蛋白C端结合。SOCC另一主要组成蛋白为Orail蛋白,是一个4次跨膜蛋白,在绝大多数细胞上皆有表达。Orail蛋白在静息状态下以二聚体形式稳定存在；当STIM1激活Orail时,其形成四聚体结构形式而发挥功能。STIM1和Orail蛋白在肿瘤发生发展研究中的报道越来越多。在神经胶质瘤细胞的研究发现,沉默SOCE的两个重要组成成分STIM1和Orail蛋白,抑制细胞外Ca2+内流可以促进胶质瘤细胞凋亡。在头颈部鳞癌中,STIM1表达高的患者其预后较差。但是关于其在骨肉瘤细胞中的研究鲜有报告。因此,本研究将探讨STIM1和Orail蛋白在骨肉瘤细胞增殖和凋亡中的作用,并对其机制进一步研究。目的首先研究小RNA干扰技术(siRNA)敲低STIM1和Orail蛋白后,HOS细胞活力和增殖的变化；然后观察敲低STIM1和Orail蛋白和HOS细胞周期及细胞凋亡的关系；最后探讨敲低STIMl和Orail蛋白影响HOS细胞增殖和凋亡是否和细胞生存和增殖相关信号通路蛋白ERK磷酸化、NF-kB核转位的变化,周期蛋白关键cyclinD1表达的改变和线粒体凋亡通路蛋白bax/caspase-3表达的变化等有关。方法采用骨肉瘤细胞系HOS作为研究的细胞。用小RNA干扰技术(siRNA)沉默HOS细胞内STIM1和Orail蛋白的表达,用Western blot方法检测STIM1和Orail蛋白被干扰的效率；Fluo-4-AM染色后激光共聚焦显微镜检测STIM1和Orail蛋白被沉默后对SOCE介导的细胞内Ca2+浓度的变化；MTT法检测STIM1和Orail蛋白被沉默后细胞活力和增殖的变化；流式细胞技术检测STIM1和Orai1蛋白被沉默后细胞周期和凋亡的变化。同时,用Western blot检测ERK磷酸化、NF-kB核转位的变化,周期蛋白cyclinD1和线粒体死亡通路蛋白bax/caspase-3的变化。结果1. STIM1-siRNA和Orail-siRNA成功敲低了STIM1和Orail蛋白表达。用商业化合成的STIM1-siRNA和Orail-siRNA干扰片段转染HOS细胞,采用Western blot技术检测。结果显示,STIM1-siRNA和Orail-siRNA转染细胞24小时后,STIM1-siRNA组STIM1蛋白表达分别较control组和negative-siRNA组明显减少,Orail-siRNA组Orail蛋白表达也分别较control组和negative-siRNA组明显减少。2. STIM1和Orail蛋白被沉默后对SOCE介导的Ca2+内流减少。Fluo-4-AM染色后激光共聚焦显微镜检测SOCE介导的Ca2+内流后细胞Ca2+浓度变化。用TG (Thapsigargin,毒胡萝卜素)促进内质网Ca2+清空,诱导SOCE介导的Ca2+,内流内质网膜上STIM1蛋白和细胞膜上Orail蛋白形成Ca2+通道,促进Ca2+内流。结果显示,STIM1-siRNA组Ca2+升高分别较control组和negative-siRNA组明显下降,Orail-siRNA组Ca2+升高也分别较control组和negative-siRNA组明显下降,STIM1-siRNA组和Orail-siRNA组之间无明显差别。3. STIM1和Orail蛋白表达敲低后,细胞活力和增殖受明显抑制。MTT检测发现,Orail-siRNA和STIM1-siRNA干扰组24小时细胞生长相对值较control组(0.60±0.09)和negative-siRNA组(0.57±0.11)明显减少,分别为0.51±0.13和0.54+0.08；而48小时,Orail-siRNA (0.25±0.10)和STIM1-siRNA (0.37±0.06)较control组(0.68±0.07)和negative-siRNA组(0.6±0.08)明显减少；72小时,Orail-siRNA (0.17±0.03)和STIMl-siRNA(0.2±0.05)较control组(0.68±0.05)和negative-siRNA组(0.70±0.09)减少。流式细胞周期检测结果显示,Orail-siRNA和STIM1-siRNA干扰组Gl phase细胞百分比较control组(0.60±0.02)和negative-siRNA组(0.57±0.07)明显升高,分别为0.75±0.05和0.7±0.06；而G2phase, Orail-siRNA (0.18±0.02)和STIM1-siRNA (0.16±0.02)较control组(0.25±.04)和negative-siRNA组(0.28±0.03)明显减少；M phase, Orai1-siRNA (0.07±0.02)和STIM1-siRNA(0.8±0.02)较control组(0.15±.04)和negative-siRNA组(0.1±0.10)减少。流式细胞凋亡检测发现,Orail-siRNA和STIM1-siRNA干扰组细胞凋亡百分比较control组(0.09±0.02)和negative-siRNA组(0.09±0.02)明显升高,分别为0.24±0.02和0.28±0.03。4. STIMl-siRNA和Orail-siRNA抑制ERK磷酸化、NF-kB核转位和周期蛋白cyclinDl表达。STIM1-siRNA和Orail-siRNA干扰细胞24小时后,提取细胞总蛋白Westernblot检测ERK磷酸化水平和cyclinD1表达变化,同时,提取核蛋白检测NF-kB核转位。结果显示STIM1-siRNA和Orail-siRNA组ERK磷酸化、NF-kB核转位和周期蛋白cyclinD1表达水平较control组和negative-siRNA组明显下降。5. STIMl-siRNA和Orail-siRNA上调了线粒体凋亡通路蛋白bax/caspase-3表达。STIMl-siRNA和Orail-siRNA干扰细胞24小时后,Western blot检测了抑制凋亡蛋白bcl-2表达,发现STIM1-siRNA和Orail-siRNA组bcl-2蛋白表达较control组和negative-siRNA组明显下降；而STM1-siRNA和Orail-siRNA组bax蛋白和caspase-3蛋白表达较control组和negative-siRNA组明显升高。结论本研究发现敲低STIM1和Orail蛋白表达后,细胞外Ca2+流入减少,抑制ERK磷酸化、NF-kB核转位和周期蛋白cyclinD1表达,导致细胞活力和增殖能力降低；另外一方面,激活线粒体凋亡通路蛋白bax/caspase-3表达,从而促进细胞凋亡。提示STIM1和Orail蛋白构成的SOCE介导的细胞外Ca2+内流是骨肉瘤细胞生存和增殖必需的蛋白。