目的:1.明确衰老对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨和细胞老化情况以及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性的影响。2.阐明AMPK对成骨成脂分化的作用和机制。3.探讨AMPK不同亚基的功能差异。4.明确AMPK激活剂水杨酸盐对氧化应激诱导的BMSCs细胞衰老的作用。方法:1.对不同年龄大鼠和人的BMSCs,通过成骨相关染色及Realtime PCR来比较成骨能力;应用衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色以及Realtime PCR比较细胞老化情况;应用荧光染料DCFH-DA检测细胞ROS水平,应用Western blot检测AMPK活化情况。2.在前成骨细胞MC3T3-E1以及前成脂细胞3T3-L1中过表达AMPKα1,通过成骨成脂相关染色及Realtime-PCR分别检测过表达AMPKα1对于成骨成脂分化的影响。利用中和抗体和si RNA下调OPN的表达,明确OPN在AMPKα影响成骨成脂分化过程中的作用,通过挽救实验进一步验证。利用Ch IP、荧光素酶报告基因以及过表达等方法,验证AMPKα对细胞成骨成脂分化的调节是否通过AMPK-Gfi1-OPN信号通路实现。在裸鼠异位成骨模型中进行体内验证。3.通过慢病毒分别过表达MC3T3-E1细胞、原代颅骨成骨细胞和BMSCs的AMPKα1和α2亚基,利用茜素红染色和Realtime PCR比较过表达不同AMPKα亚基后细胞的成骨能力。通过TRAP染色、骨吸收实验以及Realtime PCR,比较过表达不同AMPKα亚基后MC3T3E1细胞介导破骨分化及功能的差异。通过慢病毒分别过表达3T3-L1细胞和BMSCs的不同AMPKα亚基,利用油红O染色以及Realtime PCR,比较过表达不同AMPKα亚基后细胞的成脂分化情况。4.在H₂O₂诱导BMSCs细胞衰老的模型中,加入AMPK的激活剂水杨酸盐,应用细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色以及Realtime PCR评估细胞衰老的情况,应用荧光染料DCFH-DA检测细胞ROS生成水平,应用ALP染色检测BMSCs成骨能力。用水杨酸钠处理老年大鼠BMSCs,重复上述检测。结果:1.随着个体不断衰老,BMSCs中SA-β-Gal染色增强,衰老相关基因表达增加;ALP和茜素红染色减弱,成骨相关基因表达降低;ROS生成增加,并且AMPK的活化水平明显降低。2.过表达AMPKα1后,MC3T3-E1细胞成骨能力增强,3T3-L1细胞成脂能力降低。过表达AMPKα1后OPN表达增强,下调过表达AMPKα1细胞的OPN水平,其成骨分化减弱,成脂分化增强,并且加入重组OPN可以挽救。过表达AMPKα1可下调转录抑制因子Gfi1的表达,同时使Gfi1从OPN的启动子解离,从而促进OPN的表达。3.过表达AMPKα2相比AMPKα1,细胞的成骨能力增加,此功能差异与AR及osteoactivin相关,并且MC3T3-E1细胞介导的破骨分化减弱。过表达AMPKα2相比AMPKα1,细胞成脂能力减弱,且功能的差异与AR相关。4.H₂O₂诱导BMSCs细胞衰老模型中,加入AMPK的激活剂水杨酸钠后,有效阻止了细胞衰老染色增强、衰老相关基因表达的增加、ROS生成的增加以及ALP染色的减弱。老年大鼠BMSCs经水杨酸钠处理后,ALP染色增强,衰老相关基因表达降低,ROS生成减少。结论:1.随着个体不断衰老,其BMSCs细胞明显老化,成骨能力减弱,ROS生成增加且AMPK活化水平降低。2.AMPK通过AMPK-Gfi1-OPN信号通路调控成骨成脂分化。3.AMPKα2和AMPKα1的功能存在差异,α2相比α1更能促进成骨抑制成脂,并且抑制成骨细胞介导的破骨分化。4.AMPK激活剂水杨酸盐能有效防止H₂O₂诱导的BMSCs细胞衰老和ROS生成增加,并恢复其成骨能力。