目的：构建针对端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的H1/U6双启动子表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)并研究其转录生成的siRNA/miRNA对人肝癌细胞(HepG2)端粒酶活性的干扰作用,以确定siRNA/miRNA表达载体的有效性,探索制备干扰性RNA的新途径,从而为人类肿瘤的治疗提供新方法。方法：利用融合PCR技术,针对人端粒酶hTERT基因开放阅读区1800-1818和2650-2668位点构建2条H1/U6双启动子SECs,针对其3’端非翻译区3878-3896和3964-3982位点构建2条H1/U6双启动子SECs,并构建一随机序列干扰片段为对照。利用阳离子聚合物转染试剂以及磷酸钙共沉淀法两种方法分别转染HepG2细胞,转录生成siRNA或miRNA。利用TRAP-PCR-银染法检测端粒酶活性,并对其电泳条带进行灰度扫描,计算端粒酶活性抑制率；用SYBR Green I荧光定量法直接定量端粒酶活性,分析H1/U6双启动子SECs对HepG2细胞端粒酶活性的干扰作用。结果：2.5%的琼脂糖凝胶电泳分析以及测序结果显示成功构建了针对端粒酶hTERT的H1/U6双启动子SECs。与对照组相比,针对不同位点的SECs的各转染组,端粒酶活性出现不同程度的抑制。采用阳离子聚合物转染法,针对位点1800-1818、2650-2668、3878-3896和3964-3982的各转染组细胞端粒酶活性抑制率分别为42.38%、61.80%、77.95%、79.51%；采用磷酸钙共沉淀法各转染组细胞端粒酶活性抑制率分别为20.19%、27.38%、42.53%、64.3%。结论：利用融合PCR成功构建了SECs,并且其对HepG2细胞端粒酶hTERT基因表达有明显的干扰作用。这一方法可为合成干扰RNA提供新的方法,为高通量筛选有效的干扰位点和建立RNAi文库开拓新思路,为临床开展针对肿瘤端粒酶基因干扰的实验研究奠定了基础。