论文部分内容阅读
小麦白粉病是由白粉菌（Erysiphe graminis Dc. f. sp tritic Marchal）引起的世界性真菌病害，控制白粉病的有效途径是培育抗性品种。南京农业大学细胞遗传所培育的6VS/6AL易位系带有目前我国最有效的抗白粉病基因Pm21。本研究以抗病易位系6VS/6AL及感病亲本扬五为材料，分离、克隆、分析与白粉病抗性相关的基因，以期深入研究Pm21基因的抗病分子机制，并为最终克隆Pm21基因奠定基础。 1．根据抗病基因保守结构域设计简并引物，并参照大麦、小麦、水稻等作物中分离的防卫反应基因及大麦Mlo基因设计特异引物，以经白粉菌诱导后的易位系和扬麦5号cDNA为模板进行RT-PCR筛选。共获得8个与小麦白粉病抗性相关的侯选基因。其中，利用特异引物，从小麦中分离获得了与大麦病程相关蛋白1、类甜蛋白及小麦β-（1.3，1.4）葡聚糖苷酶高度同源的基因序列，进一步利用RACE技术获得了小麦病程相关蛋白1全长cDNA克隆（Ta-Prl）（GenBank登录号AF384143），通过筛选已构建的易位系cDNA文库，获得了小麦类甜蛋白全长cDNA克隆（Ta-TLP）（GenBank登录号AF384146）；利用简并引物，从小麦易位系cDNA中，首次分离Cyclophilin基因（Ta-Cyp）（GenBank登录号AF384147）和H~+-ATP酶基因序列（Ta-MAH）（GenBank登录号AF384148）以及与大麦、玉米等植物NBS-LRR抗病蛋白有极高同源性的cDNA序列（Ta-RP）；根据大麦白粉病基因Mlo，设计二对特异引物。将易位系经白粉菌诱导后，提取mRNA，并反转录成cDNA，进行PCR筛选、克隆、测序，最终获得了二个小麦Mlo基因全长cDNA克隆（Ta-Mlo、Ta-Mlo1）（GenBank登录号AF384144、AF384145），利用简并引物也从易位系mRNA反转录的cDNA中扩增获得了一段与大麦Mlo蛋白高度同源的cDNA序列。对上述分离、克隆的基因进行了序列比较研究和蛋白一级、二级结构比较分析。 2．为深入了解克隆基因是否与6VS/6AL易位系的抗病性相关，本研究将抗病易位系及感病亲本扬5经白粉菌诱导（0，12，24，48，72h）后提总RNA，转膜。进而对克隆的一系列基因进行了Northern杂交分析。结果表明，小麦病程相关蛋白1基因（Ta-Pr1）及类甜蛋白基因（Ta-TLP）为诱导表达基因（非诱导对无转录物累积），其余基因在非诱导时均有本底水平表达，但经白粉菌诱导后，表达水平明显增强，并发现各基因在经白粉菌诱导后的抗病易位系及感病亲本杨5中表达方式明显不同，证实分离、克隆的这些基因与易位系抗病性是相关的。 3．为研究克隆的基因在小麦基因组中的结构以及抗病易位系6VS上是否携有这些基因，通过提取易位系，扬5、簇毛麦、簇毛麦－硬粒小麦双二倍体DNA，进行 Southern杂交，结果表明，克隆的小麦病程相关蛋白 1 基因（TaPrl）、CyClophilin基因（Ta－Cyp）及J麦Mlo、Mlol基因（TaMlo、TaMlol）在J麦基因组中均为 2—3个拷贝，小麦类甜蛋白基因（Ta－TLP）为 l—二个拷贝，而小麦卜门．3，1．川葡聚糖苦酶（TOLMZ）和H”－ATP酶基因（TUMAH）均为单拷贝。研究发现，Ta－Prl和Ta（yp基因在扬5、易位系之间存在多态性，进一步Southern分析证实易位系6VS上携有Ta－Cyp基因。利用中国春缺体－四体系及缺失体系，己将Ta七 基因定位到小麦6A、6B、6D染色体上，将Ta－TLP定位到7B、7D染色体；并将小麦Ta－Mlo基因定位到ZAL，ZBL，ZDL的特定区域上。 4．本研究进一步通过构建表达载体，使 Ta－Mlo、TaMlo及 Ta1LP基因在大肠杆菌溶源菌 BLZI（DE／中得以表达，通过制备抗 TaMlo、TaMlo和 TaTLP表达产物的兔抗血清，对经白粉菌诱导后的抗病易位系（6VS／6AL）和感病亲本扬 5幼苗叶中表达的 Mlo、Mlo及 TLP蛋白进行兔疫印迹检测（western杂交）。结果表明，小麦叶中Ta－Mlo蛋白为膜结合蛋白；并发现仅在小麦叶经白粉菌诱导后，才能检测到该蛋白，表明Ta－Mlo蛋白为诱导表达产物。且扬5、易位系中，该蛋白在表达时问及表达量上均存在差异，暗示M。蛋白与易位系的抗病性是相关的。本研究中没有检测到 Ta－Mlo 的表达产物。研究发现，Ta－TLP蛋白存在于小麦叶细胞蛋白中，其为诱导表达产生，在诱导后的扬5、易位系中其表达量明显不同，表明该蛋白在易位系的抗病过程中有可能发挥一定作用。 5．通过田间及细胞遗传学鉴定，获得了感白粉病的小麦．簇毛麦6V缺失附加系＊n＝44）Nel石Vs2X通过 C分带及原位杂交发现感病的 6V缺失附加系中 6V染色体已丢失染色体短臂 46％的远侧端。利用现有的 12个小麦族第六群短臂 yLP探针，对该材料及抗白粉病的 6V缺失附加系uel．6Vsl）材料进行 yLP比较分析，没能找到多态性标记。需进一步寻找与之更近的分之标记，该缺失附加系材料的发现对 PmZI基因的进一步精细定位具重要作用。