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目前,心血管疾病已成为世界范围内致死致残的主要原因,其中心肌缺血/再灌注(Ischemic/reperfusion,I/R)损伤最为常见和危险。缺血心肌再灌注时,受损的心肌细胞与内皮细胞可释放IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列细胞炎性因子,随即引起局部炎症反应,进而导致心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心肌梗死面积增加以及心功能受损。研究发现,在大鼠心肌I/R中,上调低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,可以减轻心肌的I/R损伤。HIF-1α是一种氧敏感转录因子,在常氧条件下极易被降解。因此研究者多采用脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase,PHD)抑制剂二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxalyl glycine,DMOG)来稳定HIF-1α的表达,研究HIF-1α对心脏的保护作用。文献报道,HIF-1α可以减轻哺乳动物细胞及果蝇的炎症损伤,其作用与抑制NF-кB及炎症因子的表达有关。然而,在大鼠心肌I/R中,HIF-1α是否也具有类似的效应,目前尚不清楚。因此,本研究的第一部分旨在利用DMOG稳定HIF-1α表达的基础上,观察HIF-1α对大鼠心肌I/R引起的炎性损伤的影响。研究报道,Toll样受体4(TLR4)与心肌I/R炎性损伤的调节有关。在缺血时,受损的心肌组织释放的一系列损伤相关蛋白(DAMP)可激活TLR4。随后通过对一系列信号通路的应答,NF-кB表达激活并释放,引起促炎症细胞因子IL-1、IL-6以及TNF-α的释放增加,心肌损伤加重。如果抑制TLR4/NF-кB信号通路,则由I/R引起的心肌细胞丢失和炎症损伤减轻。我们前期研究发现,HIF-1α可以减少I/R大鼠的心肌线粒体损伤,从而保护心脏的结构与功能。而HIF-1α的心肌保护作用是否通过激活TLR4/NF-кB信号通路实现,未见相关报道。因此,本研究的第二部分拟在第一部分明确HIF-1α的抗炎作用后,探讨HIF-1α与TLR4/NF-кB信号通路的关系,为阐明HIF-1α心脏保护作用的机制提供一个新思路。目的:1.观察HIF-1α对大鼠心肌I/R所致炎性损伤的影响。2.探讨HIF-1α发挥抗炎作用的可能机制。方法:选取8周龄健康雄性SD大鼠68只(SPF清洁级),体重230~250 g,将其随机分为4组:(1)假手术组(Sham);(2)心肌缺血/再灌组(I/R);(3)HIF-1ɑ稳定剂DMOG+心肌I/R组(DMOG+I/R);(4)HIF-1ɑ抑制剂YC-1+心肌I/R组(YC-1+I/R)。按照经典的结扎冠状动脉左前降支法建模,心肌缺血45 min,之后再灌注3 h,留取左心室前壁组织。采用HE染色法观察心肌组织的炎症浸润情况;利用试剂盒检测心肌组织的MPO活性;Western blot法检测心肌组织的HIF-1ɑ、TLR4、NF-кB及IкB-α的蛋白表达;用Real-time PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、NF-кB及IкB-α的mRNA表达水平。结果:1.DMOG预处理可以增加心肌组织中HIF-1α的蛋白表达。Sham组有少量的HIF-1α蛋白表达,而I/R组HIF-1α的蛋白含量明显增加,达到Sham组的1.75倍(P<0.05);而给予DMOG预处理后,HIF-1α的蛋白水平进一步提高到I/R组的1.61倍(P<0.05)。运用了HIF-1α的抑制剂YC-1,结果显示与I/R组相比,YC-1+I/R组HIF-1α的蛋白水平明显降低(P<0.05)。说明DMOG可以稳定HIF-1α的表达。2.HIF-1α可减轻I/R大鼠心肌组织炎性细胞浸润。HE染色结果显示,Sham组心肌纤维排列规整,未见炎细胞浸润。与Sham组比较,I/R模型组呈现大量炎性细胞浸润,细胞肿胀且伴有明显的变性和坏死。与I/R模型组比较,DMOG干预后,炎细胞浸润明显减轻,心肌排列相对整齐,病理改变轻微。而抑制HIF-1α后,心肌细胞肿胀坏死以及炎性细胞浸润更为明显。表明HIF-1α可减轻I/R鼠心肌组织炎性细胞的浸润。3.HIF-1α可使I/R大鼠心肌组织的髓过氧化物酶(MPO)活性明显降低。与Sham组相比,心肌I/R组MPO活性显著升高(1.33±0.29 vs 0.25±0.80,P<0.01);而提前给予DMOG可以显著降低MPO的活性(0.73±0.14 vs 1.33±0.29,P<0.05 vs I/R组);给予HIF-1α抑制剂YC-1后,MPO的活性则又有所升高(2.20±0.43 vs 1.33±0.29,P<0.01 vs I/R组)。说明HIF-1α可降低心肌组织MPO的活性。4.HIF-1α对大鼠心肌I/R所致的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响。与Sham组相比,大鼠I/R后心肌组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达增加(P<0.01);提前给予DMOG后上述3种炎症因子的mRNA表达下降(P<0.01 vs I/R组);同时发现抑制HIF-1α的表达之后,上述炎症因子的m RNA水平又有所增加(P<0.01 vs I/R组)。表明HIF-1α可降低大鼠心肌I/R所致的炎症因子的表达。5.HIF-1α对大鼠I/R心肌组织TLR4/NF-кB信号通路相关蛋白表达的影响。I/R组心肌TLR4、NF-кB蛋白水平显著升高,分别约为Sham组的1.90倍、2.23倍(P<0.05)。给予DMOG后,与I/R组相比,TLR4、NF-кB的蛋白水平分别降低了0.76倍、0.78倍(P<0.01)。Real-time PCR结果同样显示,与心肌I/R组相比,DMOG+I/R组TLR4、NF-кB的m RNA水平显著下降(P<0.05)。IкB-α为NF-кB的抑制蛋白。Western blot检测结果显示,Sham组IкB-α蛋白水平维持在较高水平,而I/R组IкB-α蛋白水平显著降低(P<0.05)。在给予DMOG后,与I/R组相比,IкB-α的蛋白水平又有所升高(P<0.01)。Real-time PCR结果同样显示,与I/R组相比,DMOG+I/R组IкB-α的mRNA水平显著升高(P<0.05)。以上结果说明HIF-1α对TLR4/NF-кB信号通路有一定的抑制作用。结论:1.HIF-1α可以减轻大鼠I/R所致的心肌组织炎性损伤;2.HIF-1α的抗I/R心肌炎症作用是通过抑制TLR4/NF-кB信号通路实现的。