胚胎干细胞(ESCs)来源于胚胎内细胞团,可以在一定的培养基中无限繁殖并且不会失去多能性。因此,ESCs是研究早期阶段胚胎发生和再生医学的理想模型,准确定义ESCs命运决定的基因功能和分子机制具有重要意义。ESCs的命运受外部和内部信号的调节,控制着自我更新和分化之间的平衡。许多已知信号通路,例如LIF/STAT3,BMP/Smad/Ids,Wnt/β-catenin和Mapk/Erk通路对于ESCs的命运决定至关重要。但与这些已经研究较多的信号通路不同的是,Hippo信号通路在调节ESCs状态中的功能和信号整合机制尚不清楚。Hippo信号通路转导的关键效应分子是Yap,它通过与转录因子Teads(Tead1至Tead4)结合来调节靶基因的表达。激活的Hippo信号通路依次激活MST1/2和LATS1/2激酶,从而导致Yap的丝氨酸位点磷酸化以及随后的胞质保留和泛素连接酶介导的蛋白酶体降解。失去Yap的胚胎在原肠胚在形成后很快死亡,而激活Yap可以导致小鼠器官过度生长和组织异常扩张。然而,尽管大量研究已将Yap视为调节细胞增殖和凋亡,组织再生和肿瘤发生的关键“开关”,但其在调节ESCs多能性方面的功能仍然不清楚。Yap为65 KDa的Src家族激酶Yes相关蛋白。Yap的基本模块结构包括TEAD因子结合结构域,通过不同mRNA剪接获得的一个或两个WW结构域,SH3结合结构域,转录激活结构域(TAD)和PDZ结合基序。此外,TAD结构域内的亮氨酸拉链基序可以被完整保留或被不同的选择性剪接(AS)事件破坏。这些结构差异强烈暗示Yap的剪接体之间存在功能差异。但是据我们所知,到目前为止,还没有关于Yap剪接体在ESCs是否存在、如何存在以及如何在ESCs命运决定中发挥作用的报道。在本研究中,基于Yap剪接变体的表达模式的观察,我们分别在ESCs中建立包括Yap敲除(KO)、单个剪接体恢复的Yap KO、野生型(WT)的过表达(OE)和组成性激活的剪接体的细胞模型。此外,我们运用上述细胞模型评估了不同的Yap剪接体在调节自我更新维持,多能性退出,ESCs的早期和终末分化中的功能。主要的结论总结如下:1.Yap472和Yap488普遍存在,并且Yap剪接体在ESCs中表现出异质性表达模式;通过PCR以及测序在ESCs的cDNA样本中鉴定出Yap472和Yap488剪接体,并发现二者在不同细胞和组织中广泛表达,但在单细胞中表现出不同的表达模式,免疫荧光染色也证实Yap在ESCs中的表达存在异质性。2.Yap缺失会降低自我更新效率,促进多能性的退出,阻止ESCs的终末分化;通过建立Yap-KO的细胞模型,发现自我更新条件下其细胞形态平坦分散,增殖效率下降、细胞凋亡增多、细胞G0期阻滞、Nanog阳性率下降,qPCR和RNA-seq都发现自我更新基因下调,而分化发育相关基因上调;分化条件下,qPCR发现早期分化基因上调加速,EB形态显示晚期分化受阻。3.Yap472和Yap488功能在维持ESCs自我更新和早期分化是冗余的;在Yap-KO细胞中分别恢复Yap472和Yap488的表达,细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成实验以及qPCR检测标记基因的表达水平发现Yap472和Yap488都能恢复Yap-KO后受损的自我更新表型以及分化的变化。4.Yap剪接体依赖于Teads调节ESCs自我更新;CO-IP和HIP/HOP荧光素酶报告实验显示Yap472和Yap488都能和Tead结合并且调控下游转录水平,抑制Tead与Yap结合后,Nanog阳性率的明显下调。5.Myc在调控Yap剪接体在ESCs自我更新维持和退出中起主要作用;在Yap-KO细胞中建立诱导表达Myc模型,发现Myc能恢复Yap-KO细胞的形态、受损的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、克隆形成能力以及Nanog阳性率,ChIP实验表明Yap472和Yap488都能和Myc结合。6.Yap472比Yap488对ESCs的NE分化更重要;将Rescue细胞进行畸胎瘤实验发现Yap472细胞的畸胎瘤中出现明显的神经分化倾向,RNA-seq显示Yap KO/R-472细胞的差异基因大多与神经发育相关,三胚层定向分化实验发现,Yap472比Yap488更能促进NE发育。7.WT-Yap472 OE和WT-Yap488 OE的作用相似,尽管作用较弱,但能促进自我更新,延缓(但不阻止)ESCs多能性退出和分化。WT-Yap OE后,免疫荧光显示Yap大部分滞留于胞质中,Nanog阳性率、克隆形成实验、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡实验显示Yap472和Yap488都能够促进自我更新,qPCR检测标记基因的RNA表达水平发现分化基因略有下调。8.组成型活化Yap会损害ESCs的自我更新,并主要诱导TE转分化,而Yap472的作用更为明显。将Yap磷酸化位点突变,实现Yap组成型活化,组成型活化Yap OE后,细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡率检测显示细胞存活能力明显下调,qPCR和Cdx2免疫荧光实验显示出现TE标记基因上调,Yap472尤为明显。9.Cdx2的上调是组成型活性Yap(主要是Yap472)诱导ESCs丧失自我更新和TE分化的主要原因。ChIP实验表明组成型活化的Yap472和Yap488都能和Cdx2结合,Cdx2荧光素酶实验表明Yap472调控下游转录的能力比Yap488强。在组成型活化Yap OE细胞中KD Cdx2,细胞凋亡以及qPCR实验显示细胞存活能了和细胞分化表型都得到了大部分恢复。综上所述,我们揭示了ESCs自我更新/分化平衡和Yap之间存在的因果关系,减弱或逐渐提高多能性维持和发育信号、不同的Yap剪接体表达和激活水平的综合作用决定了ESCs的自我更新效率、分化动力学和方向。