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狭叶坡垒Hopea chinesis Hand.-Mazz.是国家一级濒危保护植物,因其抗病虫害,是天然的防腐木。本实验室前期研究发现其不同萃取层粗提物对香蕉枯萎病Fusarium oxysporum f.sp.等21种植物病原菌有较好的抑菌活性,分离并鉴定了 15个化合物。目前尚未有狭叶坡垒内生真菌的研究报道。本研究采用无菌技术对狭叶坡垒枝叶内生真菌进行分离,结合形态学、ITS序列和真菌系统发育树分析法对内生真菌进行鉴定,以7种植物病原真菌为靶标,对分离得到的8株内生真菌进行抑菌活性筛选,对高活性菌株进行了初步活性研究,并对其次生代谢产物进行部分分离。主要研究结果如下:1、采用组织块培养法从狭叶坡垒枝叶中分离得到了 8株内生真菌。采用形态学和分子生物学的方法对菌株H.1、H.2、H.3、H.4、H.5、H.6、H.7、H.8进行鉴定,分离得到的内生真菌分属于2个亚门,2个纲,5个目,6个科,6个属,H.1和H.2分别鉴定为拟茎点霉属的Phomopsis sp.(NCBI登录号为 KF159989.1)和 Phomopsis sp.(NCBI 登录号为 KU512713.1),H.3 鉴定为炭角菌属的Valsaceaesp.(NCBI登录号为AB334109.1),H.4鉴定为色二孢属的LasiodipLodia pseudotheobromae(NCBI 登录号为 KY052959.1),H.5鉴定为镰孢菌属的Fusarium incarnatum(NCBI登录号为KF255423.1),H.6鉴定为毛壳菌属的Chaetomiumsp.C36(NCBI登录号为JQ936193.1),H.7鉴定为囊孢壳属的Physalospora sp.strain F1080(NCBI登录号为KU747723.1),H.8鉴定为炭角菌属的Xylariasp.F14(NCBI登录号为KF675758.1)。2、采用平板对峙法测定了 8株内生真菌对香蕉枯萎病菌4号小种Fusarium.oxysoporum Race 4、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、香蕉大灰斑病菌Curvularia lunata、番茄早疫病菌Alternaria solani、烟草灰霉病菌Botrytis cinerea、烟草赤星病Alternaria alternata、柑橘黑斑(星)病菌Phoma citricarpa等7种植物病原真菌的抑菌活性,结果表明,菌株H.2、H.3、H.4和H.8对供试的不同植物病原菌具有抑菌活性,其中H.2、H.3、H.4和H.8均对烟草灰霉病菌表现出明显的抑菌活性,H.4和H.8均对番茄早疫病菌表现出明显的抑菌活性,H.3和H.8分别对香蕉炭疽病菌和柑橘黑斑(星)病菌表现出明显的抑菌活性。3、采用菌丝生长速率法测定了菌株H.2、H.3、H.4、H.8发酵液对烟草灰霉病菌等7种植物病原真菌的抑菌活性,结果表明,菌株H.4发酵液对烟草灰霉病菌的抑制率仅为13.10%。菌株H.2、H.8发酵液对供试的病原真菌的抑制作用不显著。菌株H.3发酵液对烟草灰霉病菌、柑橘黑斑(星)病菌和香蕉枯萎病菌的抑制作用显著,抑制率分别为82.34%、49.80%和42.98%。进一步测定了菌株H.3不同发酵周期发酵液对烟草灰霉病菌的抑制作用,结果表明,发酵周期在5至20天内,发酵液对烟草灰霉病菌的抑制作用呈现随着发酵周期变长而增强的趋势,其中14、17和20天的抑制作用达到最强,抑制率分别达到80.87%、83.11%和84.46%,且三者间差异不显著,证明了菌株H.3发酵液中起抑菌活性的物质在14天后趋于稳定。4、采用菌丝生长速率法测定了菌株H.3发酵液不同萃取层对烟草灰霉病菌的抑菌活性,结果表明,其发酵液中抑菌活性主要表现在乙酸乙酯萃取层和氯仿萃取层,抑制率分别为61.40%和29.37%,说明菌株H.3发酵液中起抑制烟草灰霉病菌的活性次生代谢产物主要集中在乙酸乙酯萃取层。并进一步探究了乙酸乙酯萃取层对烟草灰霉病菌的毒力,结果表明,乙酸乙酯萃取层对烟草灰霉病菌的抑制作用显著高于对照药剂,EC50值为440.64 mg/L。5、探究菌株H.3液体发酵最适条件实验结果表明,菌株H.3的扩大培养条件是用改良的PYG作为液体发酵培养基,置于28℃,160rpm的摇床内发酵培养16天。收集发酵液后综合运用硅胶柱层析、薄层色谱、凝胶Sephadex LH-20柱层析等分离技术,对烟草灰霉病菌抑制作用最好的乙酸乙酯萃取层次生代谢产物进行部分分离,分离得到了2个化合物,化合物1鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol),化合物2待鉴定。本研究首次对狭叶坡垒枝叶内生真菌进行分离,并以植物病原真菌为靶标进行抑菌活性筛选,结果表明,分离得到的内生真菌及其发酵液对植物病原真菌具有良好的抑菌活性,是潜在的微生物农药活性次生代谢产物库,其中菌株H.3发酵液乙酸乙酯萃取层次生代谢产物有作为烟草灰霉病菌抑菌剂开发的潜力。