目的:肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率与发病率均高居世界第一。肺癌中,80%-85%是非小细胞肺癌,主要包括肺腺癌、鳞状细胞癌与大细胞癌。AMER1是第一个发现定位于X染色体上的肿瘤抑癌基因,研究报道AMER1在肺脏的正常生长发育过程中发挥着作用,但是其与肺癌的发生发展是否相关、具体的生物学作用以及涉及的分子机制尚未见报道。我们首先使用生物信息学方法明确了AMER1与非小细胞肺癌预后之间的关系;用免疫组化二步法验证AMER1在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达及其与临床病理学特征之间关系;通过转染肺腺癌A549、肺鳞癌H226细胞系中过表达和干扰AMER1的方法,探讨AMER1的分子生物学功能作用;进一步用AMER1不同截短子分别转染非小细胞肺癌细胞系研究AMER1蛋白不同片段的功能,初步探讨AMER1调控非小细胞肺癌转移中的分子生物学路径。本研究旨在阐明AMER1在非小细胞肺癌中的功能作用,揭示其参与肿瘤转移的分子机制,为临床肿瘤治疗提供新的潜在性的分子治疗靶点。方法:1、AMER1与非小细胞肺癌的临床病理特征之间的相关关系(1)生物信息学分析方法:(1)使用TCGA数据库,分析AMER1在非小细胞肺癌中的表达,分析AMER1与非小细胞肺癌临床病理特征之间的相关性。(2)利用Kaplan-Meier plot在线数据库分析AMER1与患者生存预后的关系。(2)临床病理学实验验证:(1)收集山西医科大学第二医院病理科2009年至2018年确诊的121例非小细胞肺癌的病例,其中包括肺腺癌68例,肺鳞癌53例,收集患者的临床资料包括性别、年龄、吸烟史、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移等;(2)制作121例非小细胞肺癌肿瘤及配对癌旁组织的芯片,免疫组化二步法观察AMER1蛋白在非小细胞肺癌中的表达模式,分析AMER1与NSCLC临床病理学特征相关关系。2、AMER1对非小细胞肺癌细胞系生物学功能的影响(1)AMER1过表达后NSCLC细胞系的生物学功能作用(1)AMER1过表达质粒分别转染A549细胞系、H226细胞系,采用荧光定量PCR及western blot验证AMER1基因的过表达效率;(2)利用平板克隆形成、transwell迁移实验,分别观察AMER1过表达对肺腺癌与肺鳞癌细胞周期、克隆形成能力、迁移等生物学功能作用;(2)AMER1干扰后NSCLC细胞系的生物学功能作用(1)将AMER1干扰片段分别转染肺腺癌A549细胞系和肺鳞癌H226细胞系,利用荧光定量PCR及western blot鉴定AMER1基因的干扰效率;(2)利用平板克隆形成、transwell迁移实验分别观察AMER1干扰对肺腺癌、肺鳞癌细胞克隆形成能力、迁移等生物学功能作用。3、初步探索AMER1影响非小细胞肺癌侵袭迁移的分子机制(1)AMER1不同片段表达质粒的构建利用AMER1不同截短片段PCR产物和表达质粒经双酶切、连接、转化、摇菌、质粒提取、双酶切验证酶切产物,质粒测序后,将各质粒片段分别转染A549细胞,构建AMER1不同的截短表达载体。(2)AMER1不同截短片段对A549、H226细胞的影响(1)将AMER1不同截短片段分别转染肺腺癌A549细胞系和肺鳞癌H226细胞系中,利用荧光定量PCR鉴定AMER1各质粒表达效率;(2)用Transwell方法分别观察不同截短片段对肺鳞癌、肺腺癌细胞迁移能力的影响,观察AMER1不同片段在NSCLC细胞系的独立功能作用。4、统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。采用卡方检验分析AMER1表达与临床病理特征之间关系。两独立样本t检验(Independent-Samples T test)分析荧光定量PCR结果、Transwell迁移实验、平板克隆成实验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、AMER1与非小细胞肺癌的临床病理特征相关关系(1)生物信息学分析(1)与正常组织相比,AMER1在肺腺癌中表达量无差别,在肺鳞癌表达升高。(2)生物信息学生存分析发现,AMER1的表达与肺鳞癌、肺腺癌的作用相反,在肺鳞癌中,高表达组的预后比低表达的预后好,而在肺腺癌中,AMER1高表达组的预后比低表达的预后差。(3)生物信息学分析发现,AMER1表达阳性率在女性患者比男性患者多,差异有统计学意义(P=0.000),在吸烟之间,AMER1的表达差异存在统计学意义(P=0.028),而与肺癌的类型、种族、分期之间没有显著差异(P>0.05)。(2)临床病理学实验验证(1)收集非小细胞肺癌的病例121例,肺癌主要发生在年龄大于60岁的老年人中(69,57.02%),其中肺鳞癌53例(43.80%)、肺腺癌68例(56.20%),肺鳞癌中吸烟患者(47,88.68%)较非吸烟患者(6,11.32%)发病率较高,而肺腺癌中女性发病率(36,52.94%)较男性高(32,47.06%)。(2)AMER1蛋白表达阳性率在肺腺癌(52,76.5%)和肺鳞癌(37,69.8%)中,差异无统计学意义(P>0.05);AMER1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达定位不同,在肺腺癌中AMER1表达定位主要在细胞核(43,63.24%),肺鳞癌中AMER1表达主要在细胞膜、细胞浆(24,45.28%);分析AMER1的临床病理特征发现,在肺鳞癌、肺腺癌患者中,AMER1的表达均与性别、组织学分级之间,表达有统计学差异(P<0.05),肿瘤分化程度越高,AMER1表达阳性率越高。2、AMER1对肺癌A549、H226细胞生物学功能的影响(1)AMER1过表达后NSCLC的生物学功能作用(1)AMER1过表达后,PCR和western blot结果显示,实验组AMER1的表达均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1基因成功过表达。(2)AMER1过表达后,A549细胞的克隆形成能力低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1可以抑制A549细胞的克隆形成能力。(3)AMER1过表达后,A549细胞穿过小室transwell膜的细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1可以抑制A549细胞的迁移能力。(4)AMER1过表达处理后,H226细胞穿过小室transwell膜的细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1可以抑制H226细胞的迁移能力。(2)AMER1干扰对NSCLC的生物学功能作用(1)AMER1干扰表达后,PCR和western blot结果显示,实验组AMER1的表达均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1基因成功干扰表达。(2)AMER1干扰表达后,A549细胞的克隆形成能力提高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1干扰可以促进A549细胞的克隆形成能力。(3)AMER1干扰表达后,A549细胞穿过小室transwell膜的细胞数目明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1干扰表达后可以促进A549细胞的迁移能力。(4)AMER1干扰表达后,H226细胞穿过小室transwell膜的细胞数目明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),提示AMER1干扰表达后可以促进H226细胞的迁移能力。3、AMER1不同截短片段对A549、H226细胞的影响(1)各个片段的测序结果通过BLAST比对,测序产物与NCBI公布的基因序列一致,提示成功构建了AMER1的不同功能片段的质粒。(2)各质粒分别转染A549、H226细胞,PCR验证各质粒均能在细胞中过表达,关于AMER1的不同功能片段对肺癌细胞功能影响实验目前正在进行中。结论:(1)生物信息学分析发现AMER1在非小细胞肺癌表达量不同、预后不同,免疫组化结果验证AMER1在非小细胞肺癌不同组织学类型中的表达定位不同,提示AMER1在肺鳞癌和腺癌中的作用机制可能不同。(2)AMER1在肺腺癌A549、鳞癌H226细胞系生物学功能实验,提示AMER1在不同组织学类型的非小细胞肺癌的发生发展中发挥潜在的抑癌作用,为进一步研究AMER1在非小细胞肺癌的作用提供理论依据。(3)成功构建了AMER1不同的功能片段质粒,为深入探究AMER1全长及截短片段的功能,分析AMER1影响肺癌发生进展的分子机制提供了基础工具。