【摘 要】
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流感病毒长期与人类共存,其中A型流感病毒与B型流感病毒交替流行,形成全球性的传播。B型流感病毒（IBV）易感人群为青少年、儿童、孕妇、老人等,还包括有重大疾病及免疫力低的人群,在大流行的季节,能够造成巨大的危害及经济负担。IBV有两个主要传播谱系,B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系。病毒颗粒表面囊膜蛋白血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）是流感病毒的主要抗原。近几年,针对HA和NA的
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流感病毒长期与人类共存,其中A型流感病毒与B型流感病毒交替流行,形成全球性的传播。B型流感病毒（IBV）易感人群为青少年、儿童、孕妇、老人等,还包括有重大疾病及免疫力低的人群,在大流行的季节,能够造成巨大的危害及经济负担。IBV有两个主要传播谱系,B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系。病毒颗粒表面囊膜蛋白血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）是流感病毒的主要抗原。近几年,针对HA和NA的抗体也逐渐增多。本论文对实验室之前通过外周血淋巴细胞筛选出的B型流感病毒抗体0809进行了研究。首先,将不同IBV毒株的（野生型和突变体）HA胞外序列及NA的ORF构建到p CAGGS载体中,利用哺乳动物细胞表达系统293T细胞进行表达纯化,获得三聚体形式的HA-ecto蛋白。其次,利用SPR方法,测定了不同HA-ecto与0809 Fab的亲和力,结果发现,0809与不同IBV毒株的HA-ecto的亲和力最高可达到n M级别,亲和力范围在0.115μM～5.15 n M。同时利用SPR的方法,揭示出0809与流感病毒的唾液酸受体竞争性与HA-ecto结合。接着,将HA全长构建到p CAGGS载体中,与NA表达质粒共转染293T细胞,获得由HA和NA蛋白组成,无基因片段的病毒样颗粒（VLP）,红细胞凝集实验测定VLP均有血凝活性。再有,更为重要的是论文测定了0809抗体体外的病毒中和效果、血凝抑制效果（HAI）。结果发现,0809能够中和2013～2019年的流行毒株或者疫苗候选毒株,IC50范围在0.30～0.80μg/m L之间;并且,0809对于2008～2019年的流行毒株或者疫苗候选毒株具有一定的HAI作用,HAI滴度范围在0.24～3.65μg/m L之间。再者,通过构建HA-ecto突变体,以及相应的HA-ORF突变体,利用亲和力测定和HAI的方法,进一步确定了N197D、E141G、I198T等BHA上面关键氨基酸位点突变对抗体结合及其HAI活性的影响。另外,该论文通过结晶及X衍射的方法,解析了0809 Fab单个分子的晶体结构;并且通过冷冻电镜技术,解析了BVHA-NJ的三聚体结构,以及0809 Fab与BVHA-NJ的复合物结构,详细阐释了抗原与抗体相互作用的分子机制。最后,该论文探究了293T细胞表达纯化的疫苗候选毒株HA-ecto蛋白的在小鼠体内的免疫原性,结果发现,HA-ecto能诱导小鼠后产生较高水平的抗体,并且对异源毒株或HA-ecto具有交叉反应活性。综上,该论文详细阐释了0809抗体作用的分子机制,表明这种具有广谱中和作用的抗体,可作为B型流感病毒的预防及治疗药物的候选。同时,抗原和抗体的相互作用研究也充分揭示了近些年来IBV的抗原变异情况,为今后IBV的防控提供了参考;另外,该论文通过研究发现,通过哺乳动物细胞表达纯化的HA-ecto蛋白具有很好的免疫原性,结合佐剂的使用,可以作为一种B型流感亚单位疫苗的候选。
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