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淫羊藿为小檗科植物淫羊藿的干燥叶,是我国传统补益中药,具有补肝肾、强筋骨、调节免疫、抗氧化、衰老、肿瘤等作用。淫羊藿多糖为淫羊藿的有效成分,具有调节免疫、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗辐射等功能。本研究采用水煎醇沉法提取淫羊藿多糖,柱层析法纯化,红外光谱与紫外光谱分析其结构,扫描电镜观察其形态,重点测定了淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞的增殖和细胞因子分泌、树突状细胞功能以及对鸡新城疫系苗免疫效果的影响。本研究的目的,旨在探讨淫羊藿多糖的结构特征及免疫增强活性,为开发应用淫羊藿多糖提供理论依据。试验包括以下四个部分:试验Ⅰ.淫羊藿多糖的制备及结构特征观察 用水煎醇沉法提取粗淫羊藿多糖EPSct,经三氯乙酸法去蛋白、DEAE-52柱层析,得到纯化的淫羊藿多糖EPS,用苯酚-硫酸法测定糖含量,红外与紫外光谱分析其结构,扫描电镜观察其超微结构。结果表明,EPSct的提取率为5.12%,EPS的糖含量为48.36%;红外光谱显示,在1621.68 cm-1和1413.48 cm-1有吸收峰,可能含有糖醛酸,在810 cm-1和870 cm-1处无吸收峰,可能不含甘露糖;紫外光谱显示,EPS在100～500 cm-1范围内无明显吸收峰,表明基本不含蛋白质和核酸;扫描电镜图显示,EPSct表面粗糙,呈片状叠加状态,结合较为致密,EPS表面光滑,呈颗粒状聚集,高倍镜下可见颗粒呈片状叠加,内部有孔。试验Ⅱ.淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞增技及细胞因子分泌的影响 用MTT法测定EPS对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度,然后取安全浓度内1.221～19.53μg.mL/15个浓度的EPS单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,分别用MTT法和ELISA试剂盒测定淋巴细胞的增殖和分泌IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-12、TNF-α的变化。结果显示,单独刺激时,EPS 5个浓度组的细胞A570值均显著高于细胞对照组,在 9.766～19.53 μcg.mL-1浓度组的IL-2和IL-4含量、在19.53 μg·mL-1组的IFN-γ和IL-12含量、在2.441～19.53μg·mL-1浓度组的TNF-α含量显著高于细胞对照组;与PHA共同刺激时,EPS 5个浓度组的细胞A570值均显著高于PHA对照组,在9.766～19.53μg·mL-1浓度组的IL-2和IFN-γ含量、在19.53 μg.mL-1组的IL-4含量、在2.441～19.53 μg·mL-1浓度组的TNF-α和IL-12含量显著高于PHA对照组。结果表明,EPS在合适的浓度能单独或协同PHA显著促进淋巴细胞增殖和淋巴细胞分泌细胞因子,从而增强细胞免疫。试验Ⅲ.淫羊藿多糖对鸡骨髓来源树突状细胞功能的影响 取3～4周龄雏鸡股骨和胫骨,分离骨髓源树突状细胞(chBM-DCs),用MTT法和流式细胞仪测定EPS对chBM-DCs增殖和吞噬功能的影响;然后加入25 ng·mL-1的rmG-CSF和rmIL-4诱导培养,用倒置显微镜其形态的动态变化,用扫描电镜与透射电镜观察培养7 d的chBM-DCs的超微形态和结构;取培养6d的chBM-DCs,加入EPS刺激,48 h后用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定其表面分子CD11c、MHCⅡ、CD40和CD86分子的表达、用MTT法测定其刺激鸡外周血淋巴细胞增殖能力、用ELISA试剂盒测定其分泌细胞因子能力的变化。结果显示,EPS可促进chBM-DCs增殖和吞噬;培养7 d的chBM-DCs具有典型的树突状形态,其表面分子CD11c和MHC Ⅱ的平均表达量分别为78%和65.3%;EPS能上调CD40和CD86的表达,使chBM-DCs刺激淋巴细胞增殖的能力加强,促进 chBM-DCs 分泌 IL-1β、IFN-y、TNF-α 与 IL-12p70、RANTES,抑制其分泌IL-10。表明EPS能促进chBM-DCs成熟和功能活化,从而增强免疫。试验Ⅳ.淫羊藿多糖对鸡新城疫系苗免疫效果的影响 测定了淫羊藿多糖对鸡新城疫系苗免疫效果的影响。将14日龄雏鸡150只随机分为5组,每组30只,除空白对照组外,均用鸡新城疫系苗免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,3个药物试验组分别按高(12mg.kg-1)、中(6 mg.kg-1)、低(3 mg.kg-1)饮水添加EPS,免疫对照组及空白对照组不服药物。分别于首免后第7、14、21、28、35天,每组随机抽取6羽翼静脉采血,检测血清ND-HI抗体效价和IFN-y、IL-2和IL-4的含量;于首免后第14、28天,每组随机抽取4羽心脏采血测定淋巴细胞增殖,每组随机抽取6羽切取十二指肠、测定小肠洗液中IL-17和sIgA的含量。结果显示,EPS高、中剂量组在5个时间点的血清抗体效价、IL-2、IL-4和IFN-y含量多显著高于免疫对照组,EPS高、中剂量组在2个时间点细胞A570值均显著高于免疫对照组,EPS 3个剂量组在2个时间点小肠洗液的IL-17、sIgA含量均显著高于免疫对照组。结果表明,EPS能显著提高血清抗体效价、促进淋巴细胞增殖和IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17、sIgA的分泌,从细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫方面增强鸡新城疫系苗免疫效果,高、中剂量的作用显著。