天然免疫系统是机体防御病原体入侵的首道防线。病原微生物感染后,机体细胞通过模式识别受体(Pattern-recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),然后激活下游信号通路,诱导炎性因子和I型干扰素的表达。Toll样受体7(Toll-like receptor 7, TLR7)位于细胞的内体上,能识别病毒的单链RNA及咪唑喹啉类成分,并诱导天然免疫应答,在抗病毒感染中具有重要作用。相较于哺乳动物TLR7,禽类TLR7的序列特征和生物功能还研究较少,目前主要集中在鸡、鸭和鹅等水陆禽类中,而飞禽如鸽TLR7的研究至今还未见报道。本研究旨在克隆和分析鸽TLR7的基因序列,挖掘其关键的配体识别位点,并探索其在天然免疫应答中的功能,从而为进一步研究鸽TLR7的结构特征和生物功能以及禽类的天然免疫积累理论依据。1.鸽TLR7基因的克隆、序列分析及其表达谱检测本研究根据禽类TLR7基因的保守序列设计出特异性引物,首次从大王鸽克隆TLR7基因。利用生物信息学软件分析其序列特征,鸽TLR7基因的开放阅读框为3144 bp,编码1047个氨基酸,结构预测表明其是一类典型的TLR,由N端的一个信号肽序列、15个LRR重复序列、一个LRR-CT和胞内TIR区组成。蛋白相互作用空间结构预测结果表明两个TLR7的膜内结构域形成典型的“m”形二聚体。糖基化和磷酸化位点预测表明鸽TLR7含有18个潜在的N-糖基化位点和38个磷酸化位点。鸽TLR7氨基酸序列与人、鼠、鸡、鸭TLR7的同源性分别为65.0%、62.2%、81.5%和83.8%。通过RT-PCR分析鸽不同组织中TLR7基因的表达差异,结果表明鸽TLR7在免疫相关组织尤其是脾脏和肝脏中具有较高的表达水平。2.鸽TLR7的免疫生物学功能及其配体识别位点的挖掘构建含有鸽TLR7的真核表达质粒pCMV-PiTLR7,转染HEK293T细胞后,Western blotting鉴定了TLR7的表达。利用NF-κB荧光素酶报告载体,在R848配体刺激后,鸽TLR7能够显著地介导NF-κB的活化,表明鸽TLR7是一类有功能的TLR。对鸽TLR7 LRR序列进行分析后,发现LRR2、LRR11、LRR13和LRR14的第15位以及LRR10的第10位均存在氨基酸的插入修饰,于是我们通过overlap-PCR的方法分别构建了这些位点缺失的TLR7突变体,并连接到pCMV真核表达载体上。利用NF-κB荧光素酶报告系统,结果显示这些插入序列的缺失完全废除了TLR7介导的NF-κB的活化,表明非经典LRR序列是TLR7发挥功能所必需的,这些序列可能是TLR7识别配体的关键位点。此外,通过qRT-PCR和ELISA方法检测了TLR7和细胞因子的表达,结果表明TLR7突变体均不能介导IL-8的产生,这与NF-κB活性检测实验结果是一致的；然而部分突变体(DellOIN10和De114IN15)可介导IFN-α和TNF-α的产生,同时,R848刺激后,鸽TLR7突变体的表达水平均有不同程度的上调,表明鸽TLR7突变体通过增加其表达量进而代偿其功能的缺陷。然而,鸽TLR7 De111IN15突变体尽管增加了其自身的表达量,仍不能有效地诱导IFN-α、IL-8和‘TNF-α的产生,表明关键LRR插入序列的缺失会导致假代偿的出现。3.鸽TLR7介导激动剂及新城疫病感染的天然免疫应答研究通过R848刺激鸽外周血单核细胞,应用荧光定量PCR的方法检测TLR7、IFN-γ、IL-6、 IL-8、CCL5和IL-10的mRNA水平,结果表明R848刺激12 h和24 h后前炎性细胞因子和相关抗病毒分子均显著上调,而TLR7的表达水平没有显著变化。分别使用新城疫LaSota疫苗株和R848激动剂肌肉注射大王鸽,通过qRT-PCR的方法检测了脾脏中TLR7及相关细胞因子的表达,结果表明R848肌肉注射组中TLR7的mRNA水平显著升高,LaSota感染组TLR7的表达在第三天时显著降低,而前炎性细胞因子和趋化因子在两个肌肉注射组中均显著上调,表明鸽TLR7介导的免疫应答与其自身的表达水平并没有必然联系。鸽TLR7能介导NF-κB的活化,显著增强前炎性细胞因子和相关抗病毒分子的产生,在天然免疫抗病毒感染中扮演了重要的作用。