甘蓝型油菜中双11遗传转化体系的优化

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油菜是世界上最重要的油料作物之一,是我国植物油的主要来源。长久以来育种学家选育出了很多优秀的油菜品种,但是常规育种周期较长,需要应用基因工程技术为油菜育种工作注入了新的活力。目前,油菜遗传转化体系存在转化效率不高且品种不同转化效率不同等问题,组培过程中还容易出现外植体玻璃化和褐化。本论文以甘蓝型油菜品种Westar,J9709和中双11三个品种为受体,研究转化过程中的各种因素对转化效率的影响,并以Westar,J9709这两个品种作为参照对中双11油菜品种的转化体系进行优化,主要结果如下:由于不同的基因型,甘蓝型油菜具有不同的转化效率。用同一批次以潮霉素标记的载体农杆菌分别侵染Westar,J9709和中双11三个品种,采用同样配方的M1,M2和M3培养基培养四周后出芽率分别为2.59%,7.67%和2.55%,其中J9709的出芽率要显著高于中双11和Westar品系。以J9709品系为受体材料,basta为筛选标记,以是否需要预培养2d进行对比,发现用M3培养基培养四周后的出芽率并没有显著差异,预培养和不进行预培养的外植体出芽率平均值分别为48.90%和47.28%。但是经过预培养的外植体形成愈伤组织的速度更快且愈伤组织体积更大,出芽时间也更早,所以进行预培养对甘蓝型油菜遗传转化是有利的。中双11的种子分别经过50%浓度的次氯酸钠溶液,50%衣物漂白液,50%商用84消毒液消毒3 min和5%次氯酸钠溶液,10%次氯酸钠溶,15%次氯酸钠溶液消毒三分钟后放到萌发培养基培养7 d后统计出芽率以及污染情况。结果显示种子使用高浓度的消毒液经过短时间的消毒更加有效,且出芽率高于用低浓度消毒液长时间消毒的种子。以中双11为受体材料,按照是否预培养2 d以及共培养2 d或者3 d的变量分成四组,用M3培养基培养四周后对比出芽率。结果显示是否预培养是影响出芽率的关键因素,但共培养时间从2d延长到3d影响不显著,且延长共培养时间会出现溢菌现象。以中双11为受体材料,在M3培养基中培养四周,前两周使用原配方M3培养基,以最后两周使用的M3培养基中添加6-BA的含量0 mg/L(对照),1 mg/L和2 mg/L分成三组,对比出芽率和玻璃化情况,出芽率平均值分别为1.08%,7.91%和5.05%。玻璃化情况均不严重,在诱导出芽的培养中添加一定含量6-BA可以显著提升出芽率并且不会加重植物组织的玻璃化现象。优化了中双11品系的遗传转化体系。构建含有潮霉素筛选标记的载体,种子经过高浓度的消毒液短时间消毒后萌发7 d,剪1 cm长下胚轴为外植体预培养2d,用OD值为0.4-0.6的农杆菌(GV3101)侵染10 min共培养48 h,将出芽培养基分为添加6-BA(1 mg/L)和不添加6-BA两种,两种培养基轮流继代。经过筛选出芽后得到的再生苗经过PCR检测外源基因已经整合到再生苗中,为阳性植株。在探索油菜下胚轴再生体系以及优化中双11转化体系的过程中,一共对7种不同载体质粒的农杆菌(GV3101)进行农杆菌介导转化,并得到不同品种再生植株一共225株。
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