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研究背景和目的胆管癌是起源于胆管系统上皮细胞的恶性肿瘤,在近几十年间,其发病率和死亡率不断上升。由于疾病潜伏期长,早期症状不明显,且缺少有效的系统治疗药物,胆管癌的预后极差。因此,旨在改善胆管癌预后的药物研发是急需的。目前,抗肿瘤药物的重定位研究方兴未艾;对已成熟的临床药物重新试验,或探索联合使用方案,或根据不同的基因背景分型使用,以拓宽药物的适应症,比重头开始的新药研发在时间和经济成本上更为节省,安全性也有所保证。肿瘤药效评估高度依赖实验细胞和动物模型,建立患者自身肿瘤来源的筛选模型对药物研发具有重要现实意义;其中,病人来源的异种移植模型（PDX）和分离培养的PDC细胞,良好地继承亲代肿瘤的特性,已广泛用于临床前的肿瘤药物研究。基于上述思路,我们建立了一系列胆管癌PDX模型,并分离培养PDC肿瘤细胞,筛选FDA批准的抗肿瘤药物库,以探索可用于胆管癌肿瘤治疗的药物;并结合多组学技术,探索药物敏感性机制,寻找分子分型靶标,为胆管癌的精准治疗提供实验基础。研究中,蛋白酶体抑制剂的效果和抑癌基因PTEN的功能被我们重点关注。研究方法1、收集新鲜的胆管癌手术切除或穿刺样本,在免疫缺陷小鼠皮下建立胆管癌PDX模型,分离培养原代PDC细胞;2、应用10例原代PDC细胞,评估抗肿瘤药物库在10μM浓度时的细胞杀伤效果;挑选具有显著抑制效果的药物及胆管癌常规化疗药物,在原代PDC细胞开展浓度梯度的药敏实验,确定IC50值;应用细胞活力实时监测系统,评估上述药物的敏感性差异。3、应用浓度梯度的蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理胆管癌细胞系,根据药物敏感性将细胞分群;检测硼替佐米敏感型和不敏感型细胞在蛋白合成、蛋白酶体活性、细胞增殖等方面的差异。4、转录组学分析硼替佐米敏感型和不敏感型细胞在蛋白酶体和PI3K-AKT信号通路中的差异,基因组学分析两群细胞的基因突变和染色体结构变异情况,重点关注抑癌基因PTEN在两群细胞中的突变和表达差异。5、应用重组质粒转染,si RNA转染,sh RNA慢病毒和Cas9-sg RNA慢病毒感染的方式建立差异表达PTEN的胆管癌细胞系;检测PTEN差异表达对蛋白酶体活性和组分表达的作用,并在细胞水平评估其对蛋白酶体抑制剂药物敏感性的影响。6、应用差异表达PTEN细胞来源的小鼠皮下荷瘤模型,PTEN阳性和阴性的PDX模型和自发胆管癌小鼠模型,体内实验评估PTEN缺失对蛋白酶体抑制剂药物敏感性的影响;依托临床试验,评估蛋白酶体抑制剂硼替佐米在PTEN缺失胆管癌患者中的治疗作用。7、通过si RNA筛选、报告基因和染色质免疫共沉淀实验,探索PTEN通过抗氧化反应元件（ARE）相关转录因子调控蛋白酶体组分转录的机制,重点关注BACH1和MAFF在上述过程中的作用;通过免疫印迹、实时定量PCR和报告基因实验检测PTEN对BACH1和MAFF表达的调控。8、检测BACH1和MAFF对蛋白酶体活性、组分表达和硼替佐米药物敏感性的影响,评估它们参与PTEN调控蛋白酶体抑制剂药物敏感性的可能。9、生物信息学预测调控BACH1和MAFF的转录因子,染色质免疫共沉淀实验验证FOXO1在BACH1和MAFF启动子区的结合情况,免疫印迹和免疫荧光法检测PTEN-PI3K-AKT-FOXO1通路对BACH1和MAFF表达的影响。10、通过分析GDSC、CTRP、CCLE和TCGA等肿瘤药敏和基因数据库,探索PTEN缺失促进蛋白酶体抑制剂药物敏感性的泛肿瘤普适性,并在前列腺癌细胞中进行验证。研究结果1、成功建立34例胆管癌PDX模型,并分离培养了10例原代PDC细胞用于后续药物筛选。2、蛋白酶体抑制剂硼替佐米和卡非佐米展现良好的细胞杀伤效果,优于胆管癌临床常用药物。3、根据硼替佐米的药物效果,可将胆管癌细胞系分为硼替佐米不敏感型（包括RBE、Huh28、FRH201和QBC939）和敏感型（包括Hu CCT1、TFK1、MA-CHA-1、HCCC-9810和SK-CHA-1）;硼替佐米敏感的胆管癌细胞具有高水平的蛋白合成速率、蛋白酶体活性和更旺盛的细胞增殖能力。4、硼替佐米敏感型胆管癌细胞系中存在蛋白酶体和PI3K-AKT信号通路的显著激活,基因组学和免疫印迹分析提示抑癌基因PTEN发生缺失。5、PTEN缺失或敲低PTEN表达促进蛋白酶体活性、组分表达和硼替佐米的药物敏感性。6、PTEN缺失促进硼替佐米在细胞系皮下荷瘤、PDX和自发胆管癌小鼠模型,以及胆管癌患者中的治疗敏感性。7、PTEN通过ARE负性转录因子BACH1和MAFF调控蛋白酶体组分的表达,不依赖NRF1和NRF2。8、BACH1和MAFF抑制蛋白酶体活性、组分表达和硼替佐米在胆管癌中的药物敏感性,并参与PTEN对上述过程的调控。9、FOXO1调控BACH1和MAFF的转录,PTEN通过PI3K-AKT-FOXO1信号通路调控BACH1和MAFF的表达。10、在多种人类肿瘤中,PTEN突变或缺失促进蛋白酶体活性,以及蛋白酶体抑制剂的药物敏感性。结论我们使用PDX模型和PDC细胞进行药物筛选实验,鉴定到蛋白酶体抑制剂可用于胆管癌的治疗;蛋白酶体抑制剂在胆管癌细胞中表现出选择敏感性,与抑癌基因PTEN的缺失相关。PTEN缺失促进细胞内蛋白质合成与蛋白酶体活性,也促进蛋白酶体抑制剂的药物敏感性。机制上,我们发现PTEN促进FOXO1的核转位,导致识别ARE元件的转录抑制因子BACH1和MAFF的表达增加。PTEN诱导BACH1和MAFF的蛋白积累和核转位,从而抑制蛋白酶体组分的基因转录。通过对GDSC、CTRP、CCLE和TCGA数据库的分析,我们发现PTEN缺失在多种肿瘤中促进蛋白酶体抑制剂的药物敏感性,提示我们的发现具有泛肿瘤的普适性。