研究背景及研究目的牙周组织再生是口腔医学研究的重点之一,是牙周病学、颌面外科学、正畸学、修复学等多学科领域研究的共同目标。近年来,关于牙齿干细胞及组织工程技术的研究进展给牙周组织生物学再生带来了新的研究方向。人牙周膜干细胞(periodontal ligaments stem cells,PDLSCs)是一类在口腔临床工作中较易获得的、来源于牙周韧带组织的间充质干细胞;也是一组具有生理性自我复制能力和多向分化潜能的异质性多能干细胞。自2004年Seo等利用单细胞克隆技术将其成功分离和培养后,PDLSCs就备受口腔医学和其他生物再生领域研究者的广泛关注,并被定义为有治疗前景的、可实现组织生物学修复的种子细胞。它发挥自身可分化成多种细胞类型的潜能,尤其是潜在分化为成骨细胞或成牙骨质细胞的能力,在体内形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨样结构物,形成新生的牙周组织结构,重建附着关系。多项实验证据亦证实,充分理解PDLSCs成骨向分化的调控机制可以更好地促进和改善牙周组织生物再生的能力,为口腔临床的骨组织维持、骨再生、修复及正畸的牙周改建提供重要的临床应用价值。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是哺乳动物基因组转录合成的一类长度超过200bp、不具备编码蛋白质功能的RNA。它最初被定义为基因组的“转录噪音”,没有生物学功能。然而,随着二代基因测序技术的广泛应用,通过对某些特异性表达lncRNA的具体分析和研究,发现lncRNA在生物学的许多领域都发挥着重要作用,如干细胞生物学、X染色体失活、个体发育、组织形成、机体代谢等。越来越多的证据表明lncRNA可从表观遗传、转录水平及转录后水平调控相关基因的表达,参与机体的多种生理和病理过程,是人类疾病发生、发展和防治的重要调节剂。在多能干细胞进行自我更新、增殖、分化、凋亡等细胞活动时,一些特异性表达的lncRNA亦发挥其潜在的调控作用,影响机体组织再生的效果。例如HoxA-AS3与PRC2蛋白复合物中的EZH2结合,抑制骨髓间充质干细胞(BMSCs)中关键成骨因子Runx2的转录和表达,并从表观遗传学层面影响干细胞的成骨向分化;lncRNA-POIR可以作为miRNA-182的竞争性内源RNA,调节靶向基因FoxO1在炎性牙周膜干细胞成骨向分化过程中的表达,为牙周炎的治疗提供新的治疗策略和诊疗目标。课题组前期的体内外实验也已经证实miRNA-21可以通过靶向调控目标因子Smad5的表达,进而调节PDLSCs成骨向分化进程。基于miRNA和lncRNA存在潜在的互作关系,我们利用生物信息学手段预测了与miRNA-21相关的lncRNA,并通过qRT-PCR技术验证和筛选出差异表达最明显的lncRNA---牛磺酸上调基因 1(Taurine upregulated gene 1,TUG1)。LncRNA-TUGl是一种长度约为7.1kb、可广泛分布于人体各种组织中的lncRNA。最初被认为是小鼠视网膜发育和光感受器形成的必需基因,在细胞核和细胞质中均有表达;沉默初期视网膜细胞中lncRNA-TUG1基因的表达,会导致细胞生长速度减慢和凋亡程度增加,引起光感受器形成受阻和视网膜发育畸形。随后的研究主要体现在肿瘤发生过程,如lncRNA-TUG1可以促进人类非小细胞肺癌(NSCLC),浸润性膀胱癌和食管鳞状细胞癌(ESCC)等肿瘤细胞的生长、增殖、程序性死亡、上皮间充质转化、迁移和信号传导等能力。另有文献报道表明,它可以与甲基化的多梳蛋白复合物PRC2中的EZH2及SUZ12结合,从而对某些生长控制基因进行精准调控。然而,lncRNA-TUG1在人PDLSCs成骨向分化过程中的表达水平、功能作用及分子调控机制,尚未见报道。本研究首先通过对分离培养的人牙周膜干细胞进行成骨向诱导,证实获取的PDLSCs具备可潜在分化为成骨细胞的能力。根据早期miRNA-21的相关实验结果和生物信息学手段,结合lncRNA可通过作为miRNA的“诱饵”,影响关联miRNA在细胞活动中的正性或负性调控这一作用机理,筛选出在牙周膜干细胞成骨向分化过程中差异表达明显的lncRNA-TUG1。为了深入探究lncRNA-TUG1如何参与和影响PDLSCs成骨向分化,我们采用慢病毒载体构建沉默表达lncRNA-TUG1的稳定细胞模型,并经过成骨向诱导培养,比对正常培养和病毒转染后培养的PDLSCs其多项成骨指标的表达差异;利用生物信息技术、qRT-PCR、Western blot 等筛选技术,探寻 lncRNA-TUG1 调控 PDLSCs成骨分化的潜在靶蛋白,分析lncRNA-TUG1与靶蛋白之间存在的相关关系;最后利用基因干扰转染技术对潜在靶蛋白进行敲减,以明确lncRNA-TUG1调控牙周膜干细胞成骨分化的分子机理。通过本研究有望阐明PDLSCs成骨分化过程中lncRNA-TUG1的调控功能,为充分理解PDLSCs成骨向分化及如何促进口腔组织再生提供重要的理论依据;并推动开发出利用PDLSCs进行组织再生的新思路和治疗方法。研究方法1.人牙周膜干细胞的分离、培养及鉴定采用较为经典的组织块联合酶消化法的培养方法,体外分离培养人牙周膜干细胞,适时对生长出的细胞进行形态学观察和绘制生长曲线;利用流式细胞术及免疫荧光技术观测间充质干细胞表面标志物STRO-1、CD146等的表达情况,实现对培养的人PDLSCs进行干细胞特性鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色、油红O染色以及实时荧光定量qRT-PCR技术检测细胞的成骨向和脂肪向分化潜能。2.筛选PDLSCs成骨分化过程中差异性表达的lncRNAs和目标lncRNA-TUG1的确定根据前期miRNA-21可调控PDLSCs成骨向分化的研究结果,应用Starbase V2.0分析软件预测出与miRNA-21相关的lncRNAs。选取第3-6代生长旺盛、性质稳定的PDLSCs进行成骨向诱导7天,采用qRT-PCR技术验证目前确认有功能作用的3个lncRNAs(TUG1、SNHG1和XIST),筛选出成骨分化前后差异表达变化最明显的目标lncRNA-TUG1。为了进一步确定lncRNA-TUG1作为下一步研究的目标分子,我们分别测量了其在PDLSCs中的亚细胞分布情况和细胞成骨向诱导0、1、3、7、10、14天时mRNA水平的变化情况。3.构建沉默表达lncRNA-TUG1的牙周膜干细胞模型,分析该lncRNA对PDLSCs成骨分化的功能作用利用上海领科生物科技公司设计合成的慢病毒载体,获得可沉默lncRNA-TUG1基因表达的慢病毒和阴性对照的慢病毒。根据感染要求,对PDLSCs进行病毒转染预实验和MOI(病毒感染复数)值的摸索,从多个RNAi干扰靶点中筛选出沉默效率最佳的有效靶点,最终获取沉默lncRNA-TUG1的牙周膜干细胞模型。随后根据实验要求,对靶细胞进行病毒感染和成骨向诱导,采用ALP染色和ALP活性来评价早期成骨分化指标碱性磷酸酶的变化,选用茜素红染色和钙离子浓度测定来评价PDLSCs钙基质的矿化程度,利用qRT-PCR技术检测成骨基因ALP、Runx2及OCN的表达水平,从而进一步分析lncRNA-TUG1在PDLSCs成骨分化过程中发挥的功能作用。4.预测、筛选lncRNA-TUG1的靶蛋白,具体分析lncRNA-TUG1调控PDLSCs成骨分化的相关分子机制通过生物信息学预测技术探寻lncRNA-TUG1调控PDLSCs成骨分化的潜在靶蛋白;采用细胞质和细胞核分离的方法,分析潜在靶蛋白的亚细胞定位情况;利用生物医学数据库、qRT-PCR、Western blot等筛选技术,确定lncRNA-TUG1 调控 PDLSCs 成骨分化过程中的靶蛋白。为了进一步检测靶蛋白对PDLSCs成骨分化的作用,我们还利用基因干扰转染技术对潜在靶蛋白进行敲减,逆向观测lncRNA-TUG1的表达水平和成骨相关指标的变化情况,以明确lncRNA-TUG1与靶蛋白在PDLSCs成骨分化过程中是否存在相关性。结果1.通过组织块联合酶消化法的培养方法,获取人牙周膜干细胞。细胞经过常规体外培养后,均在镜下呈现出成纤维细胞样形态,呈放射状生长。传代后的细胞状态良好,生长迅速,约在传代后24-48h开始呈对数增长。细胞通过流式细胞术检测和鉴定,其阳性表达间充质干细胞的表面标记物(STRO-1和CD146),阴性表达白细胞表面标记物(CD45)和血小板内皮细胞表面标记物(CD31)。细胞经成骨向诱导及脂肪向诱导培养后均呈阳性表达,表明我们培养的PDLSCs具备多向分化的干性潜能。2.结合前期miRNA-21的实验结果,通过生物信息学手段预测出19个与miRNA-21相关的lncRNAs。在PDLSCs成骨诱导7d后,从上述的候选数据中选取有功能作用的TUG1、SNHG1及XIST,qRT-PCR验证它们在mRNA水平上的差异,发现lncRNA-TUG1在成骨分化前后的差异变化最大。另外,在PDLSCs成骨诱导培养Od、1d、3d、7d时,lncRNA-TUG1表达水平以时间依赖性方式不断升高,10d、14d时表达有所下降,但较对照组仍呈上升趋势;亚细胞定位分布结果亦显示lncRNA-TUG1在PDLSCs的细胞核和细胞质中均有表达、分布广泛,但主要集中分布于细胞核。以上结果为选定目标lncRNA-TUG1可参与调控PDLSCs成骨向分化提供了数据支持。3.利用慢病毒载体对细胞进行沉默实验,转染72h后倒置荧光显微镜下观测到细胞的感染效率达到最佳,稳定而透亮的绿色荧光证实带有干扰目标序列的病毒载体已稳定转染至牙周膜干细胞。qRT-PCR的测量结果提示sh-TUG1-2#是敲除效果最好的干扰靶点。在随后的成骨诱导培养实验中,沉默lncRNA-TUG1组的ALP活性、ALP染色、茜素红染色、钙离子浓度及成骨基因(ALP、Runx2及OCN)的mRNA水平均较正常组和空载体对照组低,说明lncRNA-TUG1在PDLSCs成骨分化这一生物学活动中起促进作用。4.采用Starbase V2.0软件完成了与lncRNA-TUG1相关的28个靶蛋白预测,并通过Pubmed、Medline、Web of Science等生物医学文献数据库筛选了 10个与各类干细胞分化相关或有相关lncRNA研究的RNA绑定蛋白(RNA binding protein,RBP),完成其在PDLSCs中的亚细胞定位,发现其中6个RBP(PUM2、IGF2BP1、1GF2BP2、IGF2BP3、Lin28A 和 TNRC6A)主要分布于细胞核,以Lin28A的表达分布最盛,而其他则多分布于细胞质。沉默lncRNA-TUG1时,细胞中Lin28A的降低趋势最明显。基因共表达分析数据同样显示了 Lin28A与lncRNA-TUG1之间的相互结合能量为-11.8782kcal/mol,存在多个结合位点。此外,Weastern blot从蛋白水平也证实沉默lncRNA-TUG1后,Lin28A的表达水平较未敲除组有明显减弱。以上数据提示Lin28A是lncRNA-TUG1调控PDLSCs成骨分化的潜在靶蛋白。另一方面,从mRNA水平和蛋白水平证实利用基因转染小干扰技术(siRNA)可实现对目标因子Lin28A进行敲减。当PDLSCs中Lin28A表达降低时,lncRNA-TUG1的表达量呈下降趋势;细胞经过成骨向诱导后,相应的成骨标志(ALP染色、ALP活性、钙结节及成骨因子)的表达也降低,影响着PDLSCs向成骨细胞分化的能力。结论1.LncRNA-TUG1广泛分布于人体牙周膜干细胞。LncRNA-TUG1在PDLSCs成骨分化过程中的表达变化呈上升趋势。2.沉默lncRNA-TUG1可以使PDLSCs的ALP活性降低,抑制了钙离子的沉积和矿化,降低了成骨基因的表达,从而抑制其成骨向分化的能力。3.Lin28A是lncRNA-TUG1的靶蛋白和影响PDLSCs成骨分化的RBP。它能与lncRNA-TUG1相互作用,形成lncRNA-RBP正性调控网络,协同促进PDLSCs部分成骨基因的表达,进而实现lncRNA-TUG1促进PDLSCs成骨分化的作用。特色和创新点本课题从细胞分子水平研究了 lncRNA-TUG1在牙周膜干细胞成骨向分化中的动态表达趋势,采用干扰目的基因表达的策略和系列成骨相关的功能表征实验,证实lncRNA-TUG1可参与调控PDLSCs成骨向分化过程;通过进一步探讨其具体的分子作用机制,发现Lin28A作为lncRNA-TUG1影响PDLSCs成骨向分化的生物学靶蛋白,可以与lncRNA-TUG1结合形成lncRNA-RBP的调控网络,共同促进PDLSCs向成骨细胞分化。以上观点首次从lncRNA及RBP角度分析了 PDLSCs成骨向分化的调控机制,有助于我们更好地理解牙周膜干细胞成骨分化的分子生物学机制,有望进一步明确利用牙周膜干细胞介导和改善牙周组织生物重塑的机理,为调控牙齿干细胞促进口腔组织再生提供新的分子靶点和理论依据。