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植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-H+-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在多种非生物胁迫适应性中起着重要的作用。 目的:以新疆小拟南芥(Olimarabidopsispumila)为研究材料,克隆液泡膜质子转运无机焦磷酸酶基因,进行基因的组织表达和胁迫表达分析,并通过在模式植物中过量表达进行基因功能的初步分析。 方法:基因的克隆采用RT-PCR和RACE技术;基因的表达分析采用半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和实时荧光定量PCR(quantitativeReal-timeRT-PCR,qRT-PCR)技术;构建过表达载体p35S:OpVP,分别采用花滴法和叶盘法转化拟南芥和烟草,通过检测转基因植株和非转基因植株的相关生理指标的变化,从而分析OpVP基因的功能;通过激光共聚焦显微镜观察转p35S:OpVP-GFP拟南芥根尖细胞的GFP信号进行亚细胞定位分析。 结果:(1)从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了一个V-H+-PPase基因,命名为OpVP。OpVP基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6％,98.4%。系统进化分析表明OpVP基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP蛋白是由两个单体组成的二聚体蛋白。(2)OpVP基因在小拟南芥根、茎、叶、花和果荚等组织中都有表达,但在叶和花中的表达相对更高;500mmol/LNaCl,1μmol/LABA,20%PEG6000,1μmol/LIAA和2μmol/LGA3明显诱导OpVP基因的表达。(3)亚细胞定位初步确定OpVP定位在液泡膜上。(4)经过200mmol/LNaCl胁迫后,转p35S:OpVP烟草植株的叶绿素a、b含量显著高于非转基因烟草,而叶片丙二醛含量均低于转基因烟草植株。转基因烟草植株叶片中积累更高浓度的Na+。 结论:OpVP属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因,主要是一个液泡膜定位蛋白。OpVP基因在小拟南芥根、茎、叶、花、果荚等组织中均有表达,其表达明显受到NaCl,ABA,PEG6000,IAA和GA3的诱导。转p35S:OpVP烟草叶片中积累更多的Na+,其耐盐能力得到一定程度的提高。本研究表明过量表达OpVP基因,可以提高转基因植株的耐盐能力。