冷冻电镜单颗粒分析是目前主流的结构生物学分析方法之一。单颗粒分析主要适用于具有全同性且分散度好的蛋白质体系,对于非全同体系及生物厚切片则不适用。通常的单颗粒分析对于大尺寸蛋白及小尺寸蛋白都无法达到理想的解析程度,它们的限制因素是不同的。对于大尺寸样品,一般认为限制因素是蛋白质的柔性与埃瓦尔德球效应。蛋白质柔性破坏了单颗粒分析对蛋白质全同性的要求,埃瓦尔德球效应破坏了单颗粒分析重构的基本原理。传统上,在傅里叶空间进行的埃瓦尔德球效应矫正受限于蛋白质柔性,无法在实际数据上产生作用。本文依据埃瓦尔德球效应的实空间等效——景深效应,利用符合冷冻电镜的分辨率判据,使用模拟计算的方法给出了埃瓦尔德球效应对冷冻电镜的分辨率限制。同时,我开发了基于景深效应改正的埃瓦尔德球效应矫正算法——分块重构。我们在实际数据上应用分块重构算法,不仅第一次在单颗粒数据上突破了埃瓦尔德球效应导致的分辨率极限,并且能有效地弥补每套数据上大尺寸蛋白质的柔性导致的分辨率下降。本工作基本解决了冷冻电镜对大尺寸蛋白的限制。对于小尺寸样品,主要限制因素是小蛋白质量太小,本身散射电子的能力显著地低,导致成像信噪比低。单颗粒分析软件很难在低信噪比的颗粒照片上找到颗粒正确的空间取向,这将导致无论叠加数据多少,都无法还原正确的信号,从而限制了对小蛋白的解析能力。一种可能的提升小蛋白信噪比的方法是降低冷冻电镜工作电压。电压越低,蛋白质散射电子的能力越强,可带来更多的信号。但是降低电压,同时还会带来更强的辐照损伤,减少可用电子数。一般认为,对于一定厚度的样品,考虑了产生信号的弹性散射与辐照损伤后,存在一个使信噪比达到极大的电压,称为最适电压。现有对最适电压及其对应的信噪比提升的研究表明,低压电镜能极大提升小蛋白的信噪比。但该研究基于二维晶体衍射,不符合冷冻电镜所使用的非晶体样品。本工作在多个电压下测量了基于冷冻电镜非晶体样品的辐照损伤系数,修正了最适电压及信噪比提升,确认降低电镜工作电压能提升信噪比,但幅度较为有限。降低电镜的工作电压,还会降低直接电子探测相机对电子的探测效率。基于低能量电子产生更多背散射电子这一事实,我推断出相机探测的电子信息中存在低信噪比信息。我开发了团簇分类检测滤波算法,该算法相比于传统的电子计数算法,在探测120 keV电子的能力上,在奈奎斯特频率附近能提升约80%信噪比。使用其中的Hybrid算法,应用在多套实际数据上后,有效提升了分辨率。在最后,本工作通过实验表明,在剔除了色差导致的信号衰减因素后,低压电镜已经能够做到跟通常的300 kV电镜一样或更好的水平。本工作研究为低压冷冻电镜的发展指明了方向。