苯胺类除草剂如取代脲除草剂及酰胺类除草剂等在现代农业生产过程中被大量使用。这类除草剂中的许多种类在土壤中的残效期较长,可达几个月甚至一年以上。这些除草剂的大量使用,加之部分农户不科学用药,导致了其在土壤和水体中的残留严重超标,不仅危害自然环境,还会对下茬作物产生药害,给农业生产带来巨大的损失。此外,这些除草剂的分子结构中都含有苯胺的结构,它们在进入环境中后可被降解成苯胺类化合物及其相关产物,对环境构成进一步的污染。虽然目前已有不少关于各种农药微生物降解的研究报道,但是对苯胺类除草剂微生物降解的研究还不是很清楚,特别是在基因水平上对苯胺类除草剂降解的研究还很有限。因此,研究苯胺类除草剂降解机制,为其污染环境的生物修复提供理论指导,解除其残留药害及环境污染问题,具有十分重要的理论和现实意义。目前,国际上对苯胺类除草剂微生物降解虽也有不少研究报道,但主要集中在降解菌株的分离筛选及代谢途径的研究上,且许多分离的降解菌株都具有一定的局限性,代谢途径的研究也不够全面和彻底。在降解基因及酶的水平上研究苯胺类除草剂的降解机理则很少报道。本实验室分离筛选了几株高效取代脲类除草剂降解菌株,并对菌株进行了初步的鉴定和基本的生物学特性研究。此外,还初步研究了菌株降解取代脲类除草剂的代谢途径,但却没有对其降解机制进行进一步深入的研究。本实验室所分离筛选的菌株Sphingobiumsp.YBL2及Sphingomonassp.Y57等具有优良的性状,分别能降解一系列不同的苯胺类除草剂,其中取代脲类除草剂异丙隆(1-对异丙基苯基-3-二甲基脲)和酰胺类除草剂敌稗(3,4-二氯丙酰苯胺)等除草剂被大量使用,对环境构成了严重的污染及对下茬作物构成药害。因此,我们以此为材料对苯胺类除草剂异丙隆和敌稗的降解机制进行了进一步的研究。1降解途径的研究1.1菌株YBL2降解异丙隆的代谢途径研究本文以异丙隆为例研究了取代脲除草剂在菌株YBL2中的降解途径。首先采用HPLC及MS/MS等分析方法检测鉴定了菌株YBL2降解异丙隆的中间代谢产物MDIPU、DDIPU和4IA,并进一步研究了菌株对异丙隆已知代谢产物的降解,结果显示菌株能够有效地降解添加到基础盐培养基中的各种底物。为了进一步研究菌株YBL2开环降解异丙隆的代谢途径,本文研究了在异丙隆诱导处理下菌体静息细胞的苯胺双加氧酶活性及菌体粗酶液中的邻苯二酚1,2-和2,3-双加氧酶活性。结果表明异丙隆能够诱导菌株苯胺双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶的表达,而菌株中邻苯二酚1,2-双加氧酶活性较高,但不受异丙隆诱导。据此推测苯胺双加氧酶及邻苯二酚1,2-和2,3-双加氧酶均参与菌株YBL2对异丙隆的降解。综合降解产物的检测结果及相关双加氧酶活力的检测,本文推测了包括芳香族化合物降解关键的开环步骤在内的菌株YBL2降解异丙隆的代谢途径,即异丙隆首先经两步脱甲基,分别被转化成MDIPU和DDIPU,然后再断脲侧链生成4IA,再在苯胺双加氧酶及邻苯二酚1,2-和2,3-双加氧酶的分别催化下经由4-异丙基邻苯二酚邻位和间位开环两种途径进一步彻底降解。1.2菌株Y57降解敌稗的代谢途径研究本文研究了菌株Y57降解敌稗及3,4--二氯苯胺的代谢途径。结果表明敌稗经由3,4--二氯苯胺,4,5-二氯邻苯二酚等中间产物被菌株Y57降解。通过对菌株Y57粗酶液中邻苯二酚双加氧酶活力的检测,研究了菌株Y57降解苯胺类除草剂下游代谢产物的开环方式。结果从菌株Y57的粗酶液中检测到了邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性,表明菌株通过邻位开环途径降解苯胺类除草剂的下游代谢产物。在研究菌株降解3,4-二氯苯胺的过程中,我们还检测到了菌株对苯胺类化合物酰基化和去酰基化修饰的过程,其中3,4-二氯苯胺在菌株中的丙酰化修饰产物尚未见报道。2降解关键酶基因的研究2.1菌株YBL2基因组框架图测序随着新一代测序技术的发展,测序效率已大为提高,且测序成本也大幅降低。因此,可通过菌株基因组测序结合传统的文库构建等方法高效地获得降解基因。为研究菌株中降解苯胺类除草剂的关键酶基因,本文对菌株YBL2进行了基因组框架图测序,并从中获得了苯胺类化合物降解新基因簇。2.2苯胺类化合物降解新基因簇本文通过对菌株YBL2的基因组框架图测序,获得了苯胺类除草剂降解下游步骤的关键酶基因簇,即苯胺类化合物的降解基因簇,并将有关基因分别命名为yagQTA1A2BRCDEFGHIJKL。比对分析了基因簇上的ORF,并对该基因簇与已报道的具有代表性的苯胺降解基因簇进行了比较,结果显示:1).其与已报道基因簇在基因相似性上有较大差异。基因簇编码蛋白在氨基酸水平上与已报道基因簇的相似性在50%～80%之间,而已报道基因簇之间的相似性在90%以上。2).其在基因组成和遗传排列方式上与已报道基因簇有显著差异。3).在功能上,本文研究的基因簇被验证可降解3,4-二氯苯胺等多种苯胺类化合物。而已报道的基因簇不能降解3,4-二氯苯胺。因此,本文研究的基因簇为一个新的苯胺类化合物降解基因簇。在菌株Pseudomonas.putida KT2440中对多组分苯胺双加氧酶基因簇进行了异源表达,得到了基因簇对包括3,4-二氯苯胺在内的苯胺类化合物降解的功能验证,同时证明了调节基因yagR为苯胺双加氧酶功能表达所必须。通过GC-MS分析,鉴定了异源表达菌株转化3,4-二氯苯胺的产物为4,5-二氯邻苯二酚。此外,本文研究的苯胺双加氧酶基因簇亦被从降解菌株Y57等中通过PCR扩增得到,序列分析表明菌株Y57中的苯胺双加氧酶基因簇几乎与菌株YBL2中的苯胺双加氧酶基因簇相同。2.3敌稗水解酶基因为了在基因水平上研究菌株Y57对敌稗的降解机理,我们通过鸟枪法克隆了菌株中的敌稗水解酶基因,命名为prpH,并对其进行了一系列的序列分析。同源性比对分析表明,prpH编码蛋白与细菌组蛋白脱乙酰基酶超家族蛋白具有较高同源性。此外,本文构建了致稗水解酶基因在大肠杆菌中的异源表达菌株,并实现了敌稗水解酶基因的功能表达。纯化了具有敌稗水解活性的重组酶PrpH,初步研究了重组酶PrpH的酶学特性。综上所述,本文阐明了敌稗在菌株Y57中的降解途径及关键酶基因,鉴定了异丙隆在菌株YBL2中的开环降解途径及下游降解酶基因簇,但异丙隆降解上游的脱甲基及断脲侧链的基因还有待于进一步研究。