以丝素轻链基因片段为同源臂的家蚕基因打靶载体的构建及应用

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家蚕(Bombyx mori)幼虫具有一对发达的绢丝腺,能够大量合成分泌丝蛋白,具有作为生物工厂的潜质。为了利用丝素基因作为同源臂构建家蚕基因打靶载体,通过PCR分别克隆了家蚕丝素轻链基因E5(89bp)I5(1060bp)E6(30bp)]片段和E7(406)以及3'-flank(98bp)]片段作为同源左右臂,并进行了序列测定和分析,结果显示,该2个片段与已公开的家蚕丝素轻链基因的对应区域具有高度的同源性;利用家蚕丝素重链基因的左右臂、丝素轻链基因启动子控制的人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)表达盒以及家蚕A3启动子控制的报告基因 GFP 成功构建了基因打靶载体FibL-L-A3GFP-En-[FH-GMCSF-PolyA]-FibL-R;该载体导入家蚕丝腺组织、家蚕培养细胞,可检测到报告基因的表达。有关研究为通过基因打靶获得丝腺特异性表达hGM-CSF的转基因家蚕奠定了基础。 在家蚕基因组克隆过程中还发现了一条950bp(BmMLE,EU352872)的、与类mariner元件有关联的片段,BLAST搜寻结果显示,该序列部分区域与野蚕mariner-like element DNA、家蚕acetylcholinesterase(ace)gene第5内含子、11号染色体微卫星S1104-R序列、BmBRC-NZ3基因终止码下游序列、chorion early protein基因的内含子序列具有很高的同源性,暗示家蚕类mariner元件在家蚕基因组中发生了多次转座,并在家蚕基因组的不同区域随着进化发生了歧化。
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