CXCR4/CXCR7在SDF-1诱导间充质干细胞增殖、迁移中的作用及信号转导机制研究

来源 :桂林医学院 | 被引量 : 2次 | 上传用户:funwoods
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目的:(1)建立一种骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells, MSCs)的体外分离纯化、扩增的方法,探讨MSCs向平滑肌细胞诱导分化的可行性。(2)体外探讨CXCR4/CXCR7在SDF-1诱导MSCs增殖和迁移中的作用及与磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase, PI3K)/核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的关系,为后期整体动物实验提供实验依据。方法:(1)全骨髓培养法分离培养、鉴定MSCs,利用血小板源性生长因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)和转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)进行联合诱导,诱导期间观察细胞形态变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测平滑肌细胞特异性标记α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、钙调蛋白(calponin)、平滑肌钙结合相关蛋白(smooth muscle22α, SM22α)和平滑肌肌球蛋白重链(Smooth muscle-myosin heavy chain,SM-MHC)的表达;免疫细胞化学检测前三种标记物蛋白表达。(2)RT-PCR检测不同浓度SDF-1诱导前后MSCs的CXCR4和CXCR7的表达。以PI3K抑制剂渥曼青霉素(Wortmanin)、NF-κB抑制剂二硫代氨基吡咯烷(PDTC)、CXCR4抗体(anti-CXCR4)和CXCR7抗体(anti-CXCR7)作为工具药,四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法和Transwell迁移实验分别检测MSCs的增殖和跨膜迁移。结果:(1)①MSCs接种24~48h后,贴壁细胞多为圆形、多角形、梭形,传至第3代呈现形态均一的长梭形细胞;P3代MSCs强表达CD44,低表达CD106,不表达CD11b、CD45,具有成脂、成骨等多向分化能力。②MSCs经50ng/ml PDGF-BB和5ng/ml TGF-β1联合诱导后细胞形态明显改变,呈细长梭形,可重叠生长,局部融合后可呈平滑肌细胞典型的“峰-谷”状;RT-PCR检测结果显示MSCs诱导前后均表达a-SMA、SM22a、Calponin和SM-MHC,但诱导后表达明显增强(P<0.01);免疫细胞化学检测结果同RT-PCR基本一致。(2)①MSCs同时表达CXCR4和CXCR7,SDF-1诱导后CXCR4表达增高(P<0.01),而CXCR7表达无明显变化(P>0.05)。②SDF-1组MSCs的增殖和跨膜迁移较正常对照组显著提高(P<0.01),且具有一定浓度依赖性。③SDF-1+Wortmanin组(E)、SDF-1+Wortmanin+PDTC组(F)、SDF-1+anti-CXCR4组(G)和SDF-1+anti-CXCR7组(H)细胞的增殖较同等剂量SDF-1组显著降低(P<0.01),而同型抗体IgG组(I)与同等剂量SDF-1组相比无统计学意义(P>0.05),另外,SDF-1+Wortmanin+PDTC组细胞的增殖亦低于SDF-1+Wortmanin组(P<0.05)。④SDF-1+Wortmanin组(E)、SDF-1+Wortmanin+PDTC组(F)和SDF-1+anti-CXCR4组(G)细胞的迁移较同等剂量SDF-1组显著降低(P<0.01),而同型抗体IgG组(I)和SDF-1+anti-CXCR7组(H)与同等剂量SDF-1组相比无统计学意义(P>0.05),另外,SDF-1+Wortmanin+PDTC组细胞的迁移亦低于SDF-1+Wortmanin组(P<0.01)。结论:(1)①全骨髓贴壁培养法及其扩增后可获得大量纯度较高的间充质干细胞;②大鼠骨髓间充质干细胞中存在能分化为平滑肌细胞的前体细胞——平滑肌祖细胞,并且可在PDGF-BB和TGF-β1联合诱导下分化为平滑肌细胞。(2)①SDF-1可能通过上调CXCR4的表达并与之结合在促进MSCs的体外增殖和迁移中起关键作用,而CXCR7对增殖有一定作用,但对迁移无明显影响;②PI3K/NF-κB通路相关信号分子可能参与调控SDF-1诱导的MSCs的体外增殖和迁移。
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